Moleküler Biyoloji transkripsiyon Transkripsiyon Transkripsiyon-Replikasyon Farkları 1.Replikasyon sırasında tüm kromozom kopyalanır fakat transkripsiyonda sadece bir gen bölgesi kopyalanabilir. 2. Transkripsiyon düzeyi organizmanın o andaki protein ihtiyacına bağlı olarak değişir. Her dokuda aynı anda farklı genlerin transkripsiyonu olur. 3. Transkripsiyon replikasyonda olduğu gibi bir primer’e ihtiyaç duymaz. Transkripsiyon için sadece bir DNA zinciri kalıp olarak iş görür. 4. DNA segmentinin başı ve sonunu belirleyen spesifik düzenleyici dizeler hangi DNA segmentinin şablon olarak kullanılacağını gösterir. 5.RNA polimerazın proofreading aktivitesi yoktur. RNA Çeşitleri tRNA - küçük, 80 nt uzunluğunda, antikodon sekansı içeren, single strand ve ikincil katlanmalar geçirmiş bir moleküldür. mRNA’daki bilgileri okur ve uygun amino asidleri ribozoma taşır. rRNA - ribozomların yapısal bileşenidir. mRNA- bir gen veya gen seti ile bir veya daha fazla polipeptidin amino asid dizisini kodlar. hnRNA- ökaryotlarda olgunlaşmamış öncül mRNA (pre-mRNA) molekülüdür. small nuclear RNA (snRNP's)- spliceosome oluşumunda yapısal ve katalitik rol oynar. 5 snRNP's spliceosome yapıısna katılır. [U1, U2, U4, U5, & U6]; SRP (signal recognition particle)- scRNA, ER’a hedeflenmeyi sağlayan protein-RNA kompleksinin bileşenidir ve polipeptitteki sinyal dizilim ile belirlenir. micro RNA's (micro-RNA)- antisense RNA & interfereing RNA olarak da adlandırılır. mRNA bağlanarak inaktive eden 20-24 nt uzunluğundaki kısa RNA molekülleridir.Gen ekspresyonunu regüle eder. Prokaryotik- Ökaryotik RNA polimeraz enzimler Prokaryotlarda, RNA polimeraz kompleks tek bir enzimdir. Kompleks ?2ßß´? ve promotor bölgesini tanıyan ? subünitesinden oluşur. Enzimin aktif formuna holoenzim denir.ß ß ß ß ve ß ß ß ß katalitik bölgelerdir ve transkripsiyon için aktif merkezi oluştururlar. Ökaryotlarda,3 farklı tiptedir: RNA polimeraz I, II, III RNA polimeraz I (Pol I) tek tip RNA sentezinden (preribozomal RNA) sorumludur. Bu RNA 18 S, 5.8 S ve 28 S rRNA’lar için prekürsördür. RNA polimeraz II (Pol II)’nin temel fonksiyonu mRNA ve bazı spesifik RNA’ların sentezidir.Bu enzim binlerce farklı RNA bölgesini tanıyabilir. RNA polimeraz III (Pol III); tRNA, 5 S rRNA ve bazı küçük özel RNA’ları sentezler. Transkripsiyon için temel gereksinimler ? RNA polimeraz enzimi DNA kalıbı (sadece bir DNA zinciri kalıp olarak iş görür, replikasyonda her iki zincirin tam kopyası çıkarılıyordu!!!!! ) NTP (ATP, GTP, UTP ve CTP) (dNTP değil !!!) Mg2+ ihtiyaç vardır. RNA polimerazlar transkripsiyona başlayacağı gen bölgesini nasıl tanır ? Promotor, RNA polimerazın transkripsiyonu başlatmak üzere DNA’ya bağlandığı özel bölgelerdir. Bakteriyel promotorlarda -10 (5´) TATAAT ve -35 (5´) TTGACA olmak üzere iki konsensus dizi bulunmuştur. Üçüncü bir AT’den zengin bölge UP (upstream promotor) olarak adlandırılır ve birçok genin -40 ve -60 bölgesindedir. Promotorlardaki, konsensüs diziler türler arasında korunmuştur (tamamen aynı değildir) RNA polimeraz’ın 3´ 5´ proofreading aktivitesi yoktur. 1/10 4 -10 5 ribonükleotid hata oranı vardır. RNA hücre içinde geçici olarak sentez edildiğinden hatanın kalıcı etkisi yoktur. Prokaryotik promotor Ökaryotik promotorda, transkripsiyon başlangıcından sonraki, ~-25 bç; örn “TATA Box ve ~-50 -200 bç ilerideki . “Cat Box” = CAAT ve “GC Box” GGGCGG dizilimleri yer alır. Prokaryotik Transkripsiyonun Basamakları Ökaryotik promotor I- Initiation- başlama- Kalıba bağlanma, RNA polimerazın sigma alt birimi ile DNA’nın özgül promotor dizisine bağlanması ile gerçekleşir. Transkripsiyon için bir “buble” gereklidir. Bu E. coli’de 17 baz çifti uzunluğundadır. II- Elongation-uzama: 8-9 bç uzunluğunda RNA sentezlendikten sonra sigma faktörü RNA polimerazın yapısından ayrılır. E. coli’de zincir uzama hızı 50-90 nükleotid/saniye’dir. DNA sarmalı hızlı şekilde çözülür ve enzim bölgedeki sentezi tamamlayınca hemen eski sarmal haline çevrilir. Yeni RNA zinciri kısmı olarak DNA-RNA hibridi şeklindedir, fakat büyük kısmı tek zincirli serbest formdadır. Termination-sonlanma: Prokaryotlarda terminasyon dizileri iki tiptir: ? ? ? ? faktörü bağımlı ve (? ? ? ?-independent) Tip I (? ? ? ?-independent): Palindromik, inverse repeat dizilerinin oluşturduğu hairpin loop yapısı ile DNA-RNA hibridi kararsız hale gelir ve sentez sonlandırılır Tip II ? ? ? ? faktörü bağımlı- DNA kalıbı ve RNA Ökaryotik Transkripsiyon ve Farkları Ökaryotlarda transkripsiyon çekirdekte, translasyon sitoplazmada birbirinden tamamen ayrılmış olarak gerçekleşir. Transkripsiyonda 3 farklı RNA pol enzimi görev alır. RNA polimeraz II mRNA transkripsiyonunu yapan enzimdir. Promotorlara ek olarak genin 5’ kontrol bölgesinin dışında genin içinde ve 3’ aşağı bölgesinde de yer alabilen enhensır (Trans-acting faktörler) olarak bilinen diziler bulunur. Prokaryotlarda olduğu gibi, promotorda, iki tip dizi ihtiyacı vardır 1. Bazal elementler (transkripsiyon başlangıcından sonraki, ~-25 bç; örn “TATA Box” = TATAAAA) *AT-rich DNA 2. Proximal elementler (upstream, ~-50 to -200 bç, . “Cat Box” = CAAT and “GC Box” GGGCGG) Sentezlenen ilk RNA kopyası, olgun ökaryotik mRNA ya dönüşmek için bir dizi işlenme basamağından geçer. Bu nedenle Transkripsiyon ve translasyon birarada olmaz. Ökaryotik mRNA’lar monosistroniktir. Prokaryotik mRNA’lar mRNA modifikasyona uğratılmadan translasyonda kullanılır. Prokaryotlar nucleus içermediğinden, mRNA transkripsiyon tamamlanmadan ribozomlara bağlanarak aynı anda translasyona da katılır. Prokaryotlarda mRNA’lar polisistronik yapıdadır. Ökaryotlarda mRNA’nın İşlenmesi Sentezlenen mRNA pre-mRNA formundadır. İşlenme basamakları 1. mRNA’nın 5’ ucuna şapka (cap) yapısı takılır. 20-30 nt mRNA sentezinden sonra, mRNA’nın 5’- ucuna 7-metilguanozin 5´->5´ trifosfat bağı ile eklenir. Bu yapı mRNA’nın ribozomlara bağlanması için esastır. 2. mRNA’nın 3’ ucuna poli A kuyruğu (50-250 A nt) eklenir. Bu yapı transkripsiyon sonlanması ve mRNA kararlılığı için esastır. 3. Eğer mRNA split gen formunda ise yani intron (kodlayıcı olmayan sekanslar) içeriyorsa, Okaryotik pre-mRNA’lar genellikle intron içerirler (ve bazı virüsler) intron = ekzon bölgeleri arasında kalan non-coding DNA dizileri, exon = a.a kodlayan DNA dizileridir. Öncül mRNA yapısındaki proteine dönüşmeyecek bölgeler (intronlar) çıkartılarak proteine dönüşecek bölgeler (eksonlar) birleştirilir. Bu işleme sıplaysing (splicing) denir. Tüm intronlar 5’-GT(U) dizisi ile başlar ve AG-3’ dizisi ile biter.(Splicing için anahtar dizi) Splicing mekanizmasında gerçekleşen işlemler; C- Spliceosome kompleksi ile exonların birleştirilmesi- Küçük snRNP (nükleer ribonükleoproteinler) tarafından yürütülen bir mekanizmadır. B-Grup II intronlarda splicing (eklenme) mekanizması A-Grup I intronlarda splicing (eklenme) mekanizması RNA-DNA hibridizasyonu ile tavuk ovalbumin genindeki kodlayıcı olmayan dizelerin gösterilmesi RNA polimerazın inhibisyonu • Aktinomisin D: Antibiyotik olarak kullanılır Bakteri ve ökaryotlarda G=C baz çiftleri arasına girerek DNA yapısını bozar. • Rifampisin: Bakteriyel RNA sentezini RNA polimerazın ß subünitesine bağlanarak inhibe eder. • ?-amanitin: Pol II’yi yüksek dozlarda inhibe eder. Pol I üzerine etkisi yoktur. Post-transkripsiyonel modifikasyon, mRNA editing: 1. pre-RNA’daki nükleotidlere ekleme – çıkarma yada yapıdaki bazların kimyasal değişikliğe uğratılmasıyla (böylece mRNA’daki bazlar ilgili DNA sekansı ile tam komplemeterlik göstermez) 2. Amino asitlerin değişikliği, ekleme yada çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. RNA editing, genellikle hücre yada dokuya spesifiktir. (Örn. protozoa, slime molds, bitki organelleri, memeliler) Hücresel mRNA’lar farklı hızlarda yıkılırlar Vertebralı hücresinde ortalama mRNA yarı ömrü yaklaşık 3 saattir. Ökaryotik hücrelerde poli (A) birçok mRNA’nın stabilitesi için önemlidir. Bakteriyel mRNA’nın yarı ömrü ise yaklaşık 1.5 dakika’dır. ? RNA ribonükleazlar ile yıkılır (genellikle 5´ 3´ yönünde). Laboratuvarda polinükleotid fosforilaz enzimi sentetik RNA polimerleri yapımında kullanılır. Ribozomal RNA ve tRNA’lar da İşlenirler • Hem prokaryotik hem de ökaryotik hücrelerde ribozomal DNA’lar daha uzun olan preribozomal RNA’lardan oluşurlar. Birçok hücre 40-50 farklı tRNA içerir ve ökaryotik hücreler birçok tRNA geninin çoklu ve intron içeren kopyalarını içermektedir. • RNAase D ve RNAase P bu intronların çıkarılmasında görev alan enzimlerdir. RNAase P’nin hem RNA hem de protein komponenti bulunur. Prokaryot Ökaryot Bakteri ve ökaryotlarda tRNA oluşumu