Genetik Mühendisliğine giriş dna dizi analizi • DNA dizi analizleri yada sekanslama DNA birincil yapılarının tayininde ve nükleotid baz diziliminin belirlenmesinde kullanılan yöntemdir. Analiz bir nükleik asit dizisinin diğerine hibridizasyonuna dayanır. • İlk dizi analiz çalışmaları 1960?lı yılların başında 75-80 nükleotitlik tRNA?larla başlanmıştır. • 1970?lerin sonlarına kadar 5-10 nükleotid içeren bir nükleik asit dizisinin elde edilmesi bile zor ve çok zahmetli idi. •Maxam ve Gilbert’in kimyasal kırılma yöntemi (Maxam et al.,1977). Sanger-Coulson’un zincir sonlanma yöntemi (Enzimatik). (Sanger et al.,1977). Manuel (Radyoaktif İşaretleme) Dizi Analizi Otomatik (Fluorasan İşaretleme) Dizi AnaliziHer iki teknik de üç temel basamaktan oluşmaktadır DNA’nın hazırlanması Reaksiyonlar Yüksek voltajlı jel elektroforeziHer iki analiz sırasında da tek iplikli DNA parçaları hazırlanır.DNA dizi analiz yöntemi sırasındaki temel fark DNA fragmentlerinin üretilme biçiminden kaynaklanır. DNA’nın hazırlanması• Hem Sanger hem Maxam-Gilbert tekniğinde genel prensip, DNA?yı işaretlenmiş dört fragman grubuna ayırmaktır. • Her grubu oluşturan reaksiyon baza özeldir; belli bir bazın DNA dizisinde bulunduğu pozisyona uygun uzunlukta fragman oluşturur. • Örneğin 5 I -pAATCGACT-3 I biçiminde bir oligonükleotid için sadece C ile sonlanan fragmanlar oluşturan bir reaksiyon, dört ve yedi nükleotid uzunluğunda fragmanlar (pAATC ve pAATCGAC) meydana getirir. • Aynı oligonükleotid için G ile sonlanan fragmanlar oluşturan bir reaksiyon ise yalnızca beş nükleotidli bir fragman (pAATCG) meydana getirir. ReaksiyonlarNükleik asitleri parçalayan enzimler, fosfodiester bağını hidrolitik olarak parçalarlar; çeşitli sınıflara ayrılırlar ? Ekzonükleazlar: Nükleotidleri, zincirin ucundan başlayarak ayırırlar. ? Endonükleazlar: Tek veya çift sarmala etkili türleri vardır; tek zincire veya oluk bölgesine elektrostatik güçlerle bağlanır. ? EndoRNAz: DNA-RNA kompleksini parçalayan, 5 I fosfomonoester oluşturan, 3 I monoester ve oligonükleotid oluşturan türleri vardır. ? Restriksiyon enzimleri (kısıtlayıcı enzimler): DNA zincirlerini spesifik konumlarda kesen nükleazlardır; pekçok çeşidi vardır • Restriksiyon enzimleri, bakteriyel enzimlerdir; izole edildikleri bakteriye göre isimlendirilirler. • Her enzim, 4-7 baz çifti uzunluğunda olan, palindrom diziler diye adlandırılan spesifik bir çift kollu DNA dizisini tanır ve ayrıştırır. • Bu DNA ayrışmaları, enzim tarafından uygulanan mekanizmaya bağlı olarak ya yapışkan veya zikzaklı uçlar ya da küt uçlar ile sonuçlanır DNA?da bulunan dört baza (A, G, C, T) uyan işaretlenmiş fragman grupları elektroforetik olarak yan yana ayrıldıklarında dizinin doğrudan okunabildiği bir bandlar merdiveni elde edilir ve böylece nükleotid dizisi tayin edilmiş olur Yüksek voltajlı jel elektroforezi Jel elektroforezi yüksek çözünürlükteki DNA moleküllerini ayrıştırdığı için her iki metotta da kullanılır.Maxam ve Gilbert’in kimyasal kırılma yöntemi (Maxam et al.,1977). Maxam ve Gilbert kimyasal dizileme yöntemi hakkındaki makale, Sanger ve Coulson'un makalesinden iki yıl daha sonra yayınlamasına rağmen, [ daha popüler oldu. Bunun nedeni, Maxam-Gilbert yönteminde saflaştırılmış DNA'nın doğrudan dizilenebilmesi, buna karşın ilk Sanger yönteminde tek iplikli DNA üretilebilmesi için okunacak her DNA'nın ayrıca klonlanmasının gerekmesiydi. Ancak, zincir sonladırma yönteminin zaman içinde iyileştirilmesiyle Maxam- Gilbert dizilemesi gözden düştü, zira teknik karmaşıklığı onun standart moleküler biyoloji kitlerinde kullanılmasına olanak vermiyordu, ayrıca zararlı kimyasallara gerek gösteriyordu ve ölçeklenmesinde zordu.Bu yöntemin prensibi hidrazin, dimetil sülfat ya da formik asitin, DNA’ da bulunan bazları özgül olarak değiştirmesine ve daha sonra eklenen piperidinin değişikliğe uğramış nükleotidlerin bulunduğu noktalardan zinciri kırmasına dayanır.• Nükleotid dizisi saptanacak olan DNA önce 5?- ucundan 32P ile ya da floresan bir boya ile işaretlenir.DNA? nın iki iplikçiği birbirinden ayrılarak ya da DNA uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilerek DNA? nın yalnızca bir ucundan işaretlenmesi sağlanır. • İşaretleme sonrası DNA dört parçaya ayrılır. • DNA molekülleri dört tüpe ayrılır. • Her bir örneğe A, C, G ya da T nükleotidlerinden birini değiştirmek ve kırmak için gerekli kimyasallar eklenir. Genelde ilk pürin ve pürimidinlerin ayrımı, ardında bazların ayrımı şeklinde olur. Dimetilsülfat ile müdahale pürünlerin; hidrozin ile müdahale de pürimidinlerin arasındaki glikozit bağlarının kırılması sağlanır. Piperidin de fosfodiester bağlarının kırınımını katalizler.Hidrozin piperidin ve 1.5 M„lık NaCl yalnızca sitozini bağlar Hidrozin ve piperidin birlikte timin ve sitozini bağlar Dimetil sülfat, piperidine formikasit guainin ve adenini bağlar Dimetilsülf at, piperidine guanini bağlar Pürin Pirimidin• Reaksiyon için kısıtlı bir süre verilerek her tüpde farklı pozisyonlardaki hedef nükleotidlerden kırılmış DNA parçaları elde edilir. • Sonuçta kırılmanın olduğu pozisyona göre hepsi 5?- pozisyonlarından işaretli ancak boyları birbirinden farklı bir dizi DNA fragmenti elde edilmiş olur. Elde edilen parçacıklara uygulanarak jel üzerinde yan yana yürütülmeleri sağlanır. (Klug et al., 2000) DNA molekülleri fosfat grubu taşıdıkları için eksi yüklüdür ve anoda doğru hareket eder. Bu hareket DNA’ nın yapısına ve uzunluğuna bağlıdır. Jel boyunca kısa DNA fragmentleri daha hızlı yol alırken uzunluk arttıkça DNA’ nın hızı azalır. Elde edilen farklı uzunluklardaki fragmentlerin birbirlerinden ayrılması ve tanımlanmasında DNA’nın bu özelliği kullanılır. elektroforezUygulanan elektiriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en kısası en önde olmak üzere yol alırlar ve uygulanarak bantlar görüntülenir. İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde saptanan parçacıklar kırılma pozisyonlarına göre okunurlar. otoradyografi Elektroforez bitiminde jel, asetik asit–metanol karışımında bekletilir, Whatmann kromatografi kağıdı üzerine alınarak jel kurutucuda kurutulur. Kuruma sonrası X-ışınına duyarlı filmle kaplanır. 1-2 gün boyu oda sıcaklığında karanlık odada tutularak otoradyografisi alınır. Kimyasal kırılma yöntemi ile yapılan reaksiyonların elektroforez sonrası görüntüsü ve okuma sonucu; GGGCTGSanger-Coulson’un zincir sonlanma yöntemi (Enzimatik). (Sanger et al.,1977). Tehlikeli kimyasallardan uzak, daha hızlı bir yöntem ve kitlere uygulanılabilirliği olduğundan Maxam-Gilbert yöntemine tercih edilir.Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır. Bu yöntem için: • Tek iplikçi kalıp DNA’ya • dNTP • ddNTP • Klenov, Taq DNA polimeraz, ters transkriptaz ya da sekuenaz enzimlerinden biri • Serbest OH grubu içeren primere ihtiyaç vardırYöntemin Temeli DNA polimerazın dNTP? lerin (deoksiribonükleozit trifosfat) yanısıra deoksiribozun 3? OH grubu taşımayan ddNTP? leri de (dideoksiribonükleozit trifosfat) substrat olarak kullanabilmesine dayanır; bunlarda ribozun üçüncü C atomu deoksi halde bulunduğundan fosfodiester bağ oluşumu engellenir ve yapıya yeni nükleotit katılamadığından zincir uzaması sonlanır,bu durum Sanger yönteminin kilit noktasıdır.ddATP dATP? İlk olarak reaksiyon sonunda oluşacak ürünlerin rahat görüntülenebilmesi için DNA molekülü işaretlenir. ? İşaretleme işlemi için genelde S35, P33 yada P32 kullanılır. ? DNA polimeraz, primer kalıp DNA ve dNTP?ler ortama konulup işaretli ddNTP?nin yapıya katılması sağlanır. ? Kullanılan ddNTP?lerin konsantrasyonu diğer maddelerden daha düşük olmalıdır. ? İşaretleme primere de yapılabilir. İşaretlede sonra zincir sonlanması reaksiyonlana seçilirkalıp DNA bir primer dNTP’ lerin dördü ddNTP’lerden biri Karışım dört kısma ayrılarak dört tüpe konulur inkübasyon ?ddNTP?ler ve dNTP?ler aynı karışıma konduğunda aralarında bir yarışma olur. ?Substrat olarak dNTP?ler kullanıldığı sürece uzama devam eder. ? Sentezin herhangi bir noktasında yapıya dideoksi girdiğinde reaksiyon durur. ? Her tüpte aynı anada birbirinden bağımsız birçok reaksiyon olmuştur. ? Sonuçta primer sonundan başlayıp pramtüre sonlanmaların olduğu bölgelere kadar çeşitli uzunlukta DNA parçaları oluşur.Reaksiyonlar sonucu elde edilen DNA parçalarına elektroforez uygulanarak jel üzerinde yürütülür. Uygulanan elektiriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en kısası en önde olmak üzere jel üzerinde bir merdiven görüntüsü oluşturur. İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde, tespit edilen parçacıklar reaksiyon karışımına konulan ddNTP? nin tipine göre okunurPrimerler • Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde istenilen DNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi için özgül oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır. • Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA?nın genomik DNA?dan eldesinde, çoğaltılmasında kullanılır. • Ayrıca primerler yöntemin son aşaması olan sonlanma reaksiyonunda polimeraz enzimi için uygun 3? ucu sağlar. • Her iki reaksiyondaki primer çifti aynı olabileceği gibi farklı primerler de kullanılabilir. • Gen bölgesinin elde edilmesinde kullanılan primer çifti dizi analizi yapılacak bölgenin daha dışından seçilip dizi analizi reaksiyonunda kullanılan primer ise bu primerlerin arasında ve dizinin analizi yapılacak bölgesine daha yakın olmalıdır. • Sekanslama reaksiyonunda tek bir primer kullanılır ve böylece reaksiyon yönü tayin edilmiş olur.Kalıp DNA • Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde hem çift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir. • Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction, PCR) tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır. • PCR ürünü kalıp DNA, önce reaksiyon artıklarından arındırılmalıdır. Bu çok özen gösterilmesi gereken bir aşamadır. Eğer kalıp DNA yeterince temizlenemezse bir sonraki sonlanma reaksiyonuna aktarılacak olan kimyasallar ile primer artıkları reaksiyonun hassasiyetini bozacaktırEnzimler E.coli Klenow Fragmenti DNA Polimeraz I İlk geliştirilen yöntemde kullanılan bu enzimin iki büyük dezavantajı vardır. Ters Transkriptaz • Ters transkriptaz (Reverse transcriptase) enziminin her ne kadar çok yaygın bir kullanım alanı olmasa da özellikle homopolimerik bölgelerde etkin çözüm verir. • Enzim özellikle bu tip bölgelerde Klenow fragmentinden daha etkin ve kullanışlıdır.Sekuenaz Enzimleri • Sekuenaz (SequenasesTM) enzimleri T7 bakteriofajın?dan elde edilirler. • Enzimin 3?-5? ekzonükleaz aktivitesi inhibe edilmiştir. • İnhibe edilen bu özelliği sayesinde enzim tek yönlü ve hızlı çalışır. • Kalıp DNA? nın uzun olduğu deneylerde yüksek özgül aktivitesi ve dayanıklılığı ile tercih edilir.Taq DNA Polimeraz • Özelilikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasında tercih edilir. • Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygın kullanılan enzim türüdür. • Özellikle 95 0C? da aktif olması nedeni ile homopolimerik bölgelerde bile çok etkindir.Sanger Yöntemi Manuel (Otomatik Olmayan ) Sekans Yöntemi Otomatik Sekans Yöntemi Çift Zincir Sekanslama Döngüsel SekanslamaÇift Zincir Sekanslama ? Klasik Sanger yönteminde tek zincir kalıp olarak kullanılmasına karşın, bu yöntemde çift zincir DNA kalıp olarak kullanılır. ? Sekans reaksiyonu ana hatlarıyla dört basamaktan ibarettir: a. DNA’nın denatürasyonu, b. Primerlerin kalıba yapışma (annealing), c. İşaretleme (radyoaktif madde ile) ve d. Sonlandırmabasamaklarından oluşmaktadır. Araştırmacılar yaygın olarak T7-Polymerase kit ve Sequenase 2.0 USB-kitlerini tercih etmektedirDöngüsel Sekanslama ?Döngüsel sekanslama, geleneksel Sanger sekanslama metodunun bir modifikasyonudur. ?Deoksinükleotidler kullanılarak 3? uçları dideoksinükleotidle sonlanmış DNA fragmentleri yapmak için polimerizasyon reaksiyonu kullanılır. ?Temel farklılık, döngüsel sekansta kullanılan DNA polimerazın 95°C?de aktivitesini koruyor olmasıdır. ?Bu polimerazın kullanılmasının avantajı, DNA?nın denatürasyonu ve “annealing” basamaklarının ve zincir sentez basamağının aynı tüpte birçok defa tekrarlanmasına izin vermesidir.Manüel sekanstan temelde iki büyük farka sahiptir İşaretleme basamağında radyoaktif madde yerine floresan boya kullanılması Otoradyogram yerine lazer ve optik okuma sisteminin birarada çalıştığı, bilgilerin bilgisayar ortamına direkt taşındığı otomasyonun sağlanması Kapiller elektroforez sisteminin devreye girmesiyle birlikte, sistem daha hızlı ve etkin hale gelmiştirPCR ile çoğaltılan gen bölgesine ait ürün pürifiye edildikten sonra floresan işaretli dideoksinükleotidlerin kullanıldığı döngüsel sekanslama reaksiyonuna tabi tutulur. Pürifikasyon sonrasında örnekler sekans cihazına yüklenir ve cihaz otomatik olarak örnekleri kapillere çeker, yürütür, lazer ışığı altında optik sensör tarafından okur ve okuduğu ham bilgileri bilgisayar programına aktarır1 laneOtomatik Dizi Analizi Cihazları Jel Sistemli Cihazlar (ABI Prism 370, 373, 377) Kapiler Sistemli Cihazlar (ABI Prism 310, 3100, 3700)• Kendinden önceki sistemlerden farklı olarak poliakrilamid jelmatriks sistemi yerine kapiler sistem içine doldurulan polimer jelmatriks sistemi içerir. • Bu polimer jelmatriks çapı nanometre ölçütlerinde olan cam borular içerisine doldurulur.Cihaz 2 kısımdan oluşur veri ünitesi elektroforez kısmı• İki ana program vardır: 1) DATA COLLECTİON TM denen ilk program elektroforezle bağlantıyı kurar 2) SEQUENCE ANALYSE TM verileri değerlendirir veri ünitesi Bu kısım hazırlanan örneğin yüklendiği ve elektroroforezin gerçekleştiği kısımdır elektroforez kısmı 3 üniteden oluşur Örnek yükleme ünitesi Jel blok ünitesi Dedektör ünitesiÖrnek yükleme ünitesinin üç kuyucuğunun ilkinde akım oluşmasını sağlayan yürütme tamponu,diğerlerinde temizliği sağlamak için distile su bulunur. Jel Blok Ünitesine takılan şırınga kapillere doldurulacak stok polimeri içerir,polimer bloğun son kısmı anoda açılır ve yürütme çözeltisi içerir. Dedektör ünitesinde katot görevindeki platin çubuğun yanınaki kapiler,polimer bir blokta sonlanır.• Cihaz komutu alınca uygun sıcaklığa ayarlanır. • Kapilerin serbest ucu distile su tüpüne girer,bir dizi işlem sonrası polimer kapiler içerisine tek taraflı yayılır. • Kapilerin serbest ucu örnek içine girer. • Oluşan elektriksel alan sonucu DNA parçaları kapiler boruya taşınır ve akımın kesilmesiyle kapilerin serbest ucu distile su içine döner.• Kapillerin serbest ucu temizlenerek yürütme çözeltisine döner. • Cihaza ters akım verilir,DNA parçaları kapilerin serbest ucundan polimer bloğa ardından lazer ünitesine geçer ve yaydığı floresan ışıkla tespit edilir. Fluorescent Dyes Used in 4-Color Detection Fluorescent FAM (Blue) JOE (Green) TAMRA (Yellow) ROX (Red)? Otomatik dizi analizinde ticari olarak üretilen kitler kullanılır. ? En sık olarak ABI Prism Big DyeTM Terminatör Reaksiyon Kiti kullanılır. ? Bu PCR kitinin özelliği tüm PCR kimyasalları ile beraber, floresan boyalı ddNTP?ler ile Taq DNA Polimeraz enzimini de tek bir karışım halinde bulundurmasıdır.DNA DİZİ ANALİZİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER MAXAM-GİLBERT NEXT-GENERATİON SANGER&COULSON MANUEL DİZİ ANALİZİ OTOMATİK DİZİ ANALİZİ• Yeni nesil dizileme; genom, transkriptom, DNA-protein etkileşimlerinin geniş kapsamlı analizini ucuz, rutin ve yaygın hale dönüştürdüğünden biyolojik araştırmaları önemli ölçüde hızlandırma potansiyeline sahiptir. • İnsan genom projesinin tanımlanması post genomik alanın başlangıcı olmuştur ve sistem biyolojisi yaklaşımı büyük önem kazanmıştır. • İnsan genomundaki hücresel hemostaz, gelişim ve hastalık ilerleyişi ile ilişkili düzenleyici ağlar ve bu ağlarda rol oynayan fonksiyonel elementler tanımlanmaya başlamıştır. • Hücresel aktiviteleri düzenleyen genomdaki bu fonksiyonel elementlerin belirlenmesi ve bunların popülasyonlar arasındaki varyasyonları kişiye özgü tedavinin geliştirilmesine de temel olmuştur.Günümüzde kullanılan yeni nesil dizileme sistemleri Roche 454 Genome Analyzer Helios Pasific Bioscience Applied Biosystem SOLİD Illumina Genome AnalyzerRoche 454 Genome Analyzer PyrosequencingAdaptor B contains a 5'-biotin tag that enables immobilization of the library onto streptavidin coated beads Bead and DNA single-stranded template DNA (sstDNA) sstDNA library beads are added to the DNA Bead Incubation Mix (containing DNA polymerase) and are layered with Enzyme Beads onto the PicoTiterPlate™ device. The layer of Enzyme Beads ensures that the DNA beads remain positioned in the wells during the sequencing reaction.Pyrosequencing metodu, en basit anlatımla DNA polimeraz aktivitesinin kemilüminesan bir enzim aracılığıyla tespitidir.incubated with the enzymes, DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, and apyrase as well as the substrates, adenosine 5' phosphosulfate (APS), and luciferin. ATP sulfurylase converts PPi to ATP in the presence of adenosine 5' phosphosulfate (APS). This ATP drives the luciferase-mediated conversion of luciferin to oxyluciferin that generates visible light in amounts that are proportional to the amount of ATP . The light produced in the luciferase-catalyzed reaction is detected by a charge coupled device (CCD) camera and seen as a peak in the raw data output (Pyrogram). The height of each peak (light signal) is proportional to the number of nucleotides incorporated. Apyrase, a nucleotide-degrading enzyme, continuously degrades unincorporated nucleotides and ATP . When degradation is complete, another nucleotide is added. As the process continues, the complementary DNA strand is built up and the nucleotide sequence is determined from the signal peaks in the Pyrogram trace. ANİMASYONApplied Biosystem SOLİD3’ modificationsANİMASYONIllumina Genome AnalyzerANİMASYONHeliosANİMASYONPasific Bioscience NANO SEQUENCING $1000 a genom dizileme ABD’ den teşvik ödülleri (National Human Genome Research Institute)Nano boyuttaki karbon tüpler Elektrik akımını ölçen sensörler Tüm DNA zinciri geçiriliyor Parçalayıp birleştirme yok ‘Elektron tunneling’ denilen sistem ile bazlar arasındaki elektrokimyasal farklılıklar belirleniyor Bilgisayada okunuyorANİMASYONİlginize Te şekkür Ederiz..