Genetik Mühendisliğine giriş dna izolasyonu BGY 4008 GENETGK MÜHENDGSLGĞGNE GGRGg Doç. Dr. Nurettin YÖREKDNA ile çalıGırken göz önünde bulundurmanız gereken temel özellikler: DNA basit bir moleküldür. Gerçekten! Sadece A, T, C ve G nükleotidlerini içerir . Bu ne demektir? AraGtırma yaparken „önceden tahmin edebilmek? demektir. • DNA negatif yüklüdür. Elektronların büyük bir çoğunluğu oksijen gruplarının etrafında dolanırlar. • DNA çok sayıda halka yapısına sahiptir. Pi orbitali gibi Geyleri ya da polar ve nonpolar bağlar arasındaki farkı hatırlıyor musunuz? • Asıl konu Gudur ki; halka yapıları oldukça • hidrofobiktir.DNA çok dayanıklı bir moleküldür. Örnek tüpünüzü düGürdünüz mü? Muhtemelen bir sorun yoktur. Hafta sonu boyunca oda ısısında bıraktınız mı? Sorun değil. Genellikle çalıGılması en kolay olan biyolojik makromoleküldür. DNA çalışmaları pek çok ihtiyaç gerektirir. Bu molekülle ne çalıGtığınıza bağlı olarak bir çok Geye sahip olmalısınız. Bu sey bir prosedür ya da spesifik bir enzim yada techizat olabilir.UNUTMAYIN!!! Bazı genel kurallar bütün DNA deneylerinde geçerlidir • Deneyi iyi bilmek. BaGka bir Gekilde söylemek gerekirse, prosedürünüzün kimyasını bilmeniz gerekir. Bu, dikkat derecenizi ölçmeye yarar ve etkinliğinizi yansıtır. • Örneğinizi olabildiği kadar saf elde edin. gunu aklınızdan çıkarmayın: Herhangi bir safsızlık birçok soruna davetiye çıkarır. Eğer kontaminasyonunuz varsa takip eden aGamalarınızda kötü sonuçlar elde edebilir hatta örneğinizi bile kaybedebilirsiniz. DNA nükleazları sevmez ve nükleazlar her yerdedir. • Mümkün olduğunca her zaman dikkatli ve nazik olun. Deneyleri yaparken dikkatli olun. Örneğin, her Geyi soğukta tutun çünkü enzimler fizyolojik sıcaklıklarında daha çok aktiftir (soğuk buz kullanın). Eldiven giyin. DNA?yı hızlı vorteklemeyin ya da kuvvetli bir Gekilde pipetaj yapmayın. Mutlaka önlük giyin. • Lab. da birGeyler yemeyin. ……………..• Molekülünüzün özelliklerini çok iyi bilin. Molekülünüze herhangi bir uygulama yaparken bilinçli olmanız lazım. Örneğin, genomik DNA plazmid DNA?sından PCR ürününden ya da EST fragmentinden farklıdır. • Gerçekten ihtiyacınız olan malzemelerin miktarlarını dikkatlice düşünün. Küçük miktarlarla çalıGmak genellikle daha kolaydır ve DNA çalıGmalarında miktarlar hep çok küçüktür. Yani eğer biliyorsanız, çok fazlasına ihtiyacınız yoktur, o miktar yeterlidir.GENOMİK DNA: Ne ve Neden? Genomik DNA nedir? • Aslında anlaGılmaz bir terim gibidir fakat bir hücredeki, organeldeki ve/veya virüsteki bütün genleri içeren DNA örneği demektir. Genomik DNA büyüktür, komplekstir ve sulu ortamlarda visköz görünür.Neden genomik DNA elde ediyoruz? • Profilleme/Fingerprinting: Kan/sperm örneklerini karGılaGtırmak adli bilimlerde kullanılan bir metottur. • Yeni bir gen klonlamaya ilk adımKarakterizasyon/Tanımlama. Temel araGtırmada birçok örnek vardır. Mesela transgenik/knockout bir organizma yapıyorsunuz ve modifikasyonun gerçekleGip gerçekleGmediğini kontrol etmeniz gerekir. Glginç bir fenotip elde ettiniz ve daha derine bakmak istiyorsunuz. Gen ifadesi ve regülasyonunu araştırmakGenomik DNA izolasyonu : Hücre lizizi • Hücreleri hazırlayın. Soğukta tutun. Herhangi bir fiziksel Gart gerekirse sağlayın. Örnek olarak oldukça sert bir doku ile (mısır bitkisi gibi) çalıGıyorsanız. Gçerisinde sıvı azot bulunan havan ve havan tokmağı kullanacaksınız. Akılda tutmanızda yarar vardır; bu aGama hücreleri lizise etmekten ziyade, bitki hücrelerinin duvarlarını yıkmaya yöneliktir ve böylece hücreler serbest kalır. • Sonra hücre içinde bulunan DNA?yı almak için hücreleri lizis edin. Devam eden iGlemlerde DNA?ya daha rahat ulaGırsınız.Hücreleri Gunlarla lizise edin: • Tris (tamponlama maddesi pH 6-8) • EDTA DNase aktivitesi için gerekli kofaktörler olan divalent katyonları Gelatlar (nükleazları kapatma yolu) • NaCl fizyolojik Gartlarda (genellikle 100-150 mM olması gerekir). Bütün molekülleri mutlu (özellikle de proteinaz K?yı) eder ve istenmeyen çökelmeleri önler. • SDS, iyonik deterjandır. Membranları yıkma iGleminde iyidir. Genel denatüre edicidir (enzim aktivitesini inhibe eder). DNA çok dayanıklı olduğu için SDS muamelesinden etkilenmez. • Not: Bitki materyali ile çalıGırken SDS?in yerini çok yaygın bir deterjan olan Sarkosyl alır. SDS ile aynı Gekilde davranır. • Proteinaz K, serin proteaz (55 C?de iyi çalıGır). Çok etkili olduğu için ve SDS ya da diğer denatüre edici ajanlara karGı (üre gibi) hassas olmadığı için kullanılır. Proteinaz K DNA?ya bağlı olan proteinleri (ökromatin yapısındaki/histonlar vb) parçalayarak DNA?nın serbest kalmasını sağlar. Taze olarak kullanılması en iyisidir (oldukça önemlidir bu aGama).• Gnkübasyon süresi genellikle en az bir saattir. Bazı prosedürler daha uzun sürer (kullanılan materyale göre değiGir örneğin birçok prosedür 16 saatten fazla gece boyu inkübasyon süresi kullanır). • Lizis prosedürünün birçok çeGidi olduğunu anlamak çok önemlidir. Bazısı daha hızlı, bazısı daha etkin, bazısı daha pahallı, bazısı belirli Gartlarda çalıGır. SDS/proteinaz K oldukça standart bir yöntemdir. DNA extraksiyonu (Fenol/kloroform ile) • Dikkat!!!! Fenol oldukça tehlikelidir. Yanıcıdır. (bir zamanlar birinin bana söylediği gibi eğer vücudunun %5?ni kaplarsa, ölürsün) Ancak biz mantıklı miktarlarda ve çekerbaca içerisinde kullandığımız için sorun olmayacaktır. Eğer üzerinize dökülürse paniklemeyin. Hemen soğuk su ile durulayın. • Fenol, genellikle bir tamponla doyurulur. (hazır olarak aldığınızda ya da kendiniz hazırladığınızda iki faz içerdiğini görürsünüz. Üst faz tamponun fazlasıdır, alt faz ise tamponla doyurulmuG fenoldür.) Bu pH için önemlidir- sizin saflaGtırma iGleminiz için nötral pH?da fenol gerekilidir. (asidik pH, DNA fenol içinde çözülür hale geleceği için iyi değildir.) Aynı zamanda doygunluk da önemlidir çünkü bu herhangi bir sulu çözelti (örn.su) eklendiğinde, onun da kendi sıvı tabakasını yaratacağı anlamına gelmektedir.• Fenol-kloroform saflaGtırma yöntemi “diferansiyel (kademeli) çözünürlük” prensibine bağlı olarak çalıGmaktadır. • 1. Lizat üzerine eGit hacimde fenol/kloroform/izoamil alkol (genellikle hacimsel olarak 24:23:1 oranında hazırlanır) eklenir. Fenol- organik çözücü/ nükleik asitler çözünmez. Bundan dolayı, DNA/RNA sulu faz içinde çözünmüG halde kalır. Lipidler ve polisakkaritler tercihen fenol fazına geçerler. Proteinler de seçici olarak fenol çözeltisine geçerler. • 2. Ayrıca fenol bir denatüre edici olarak davranır, proteinler denatüre olarak çökelek oluGtururlar ve ara fazda toplanırlar. • 3. Kloroform, fenolle genel olarak benzer özelliklere sahiptir (çözücü özellikleri), ayrıca sulu ve organik fazlar arasındaki dayanıklı olmayan bağları stabilize eder. Izoamil alkol de ara fazın stabilizasyonuna katkı sağlar ve aynı zamanda kabarcık oluGumunun önlenmesine yardım eder.• Genellikle bu basamak 2 ya da 3 kez tekrarlanır. Daha fazla tekrar edilmesi, örneği daha temiz hale getirir (her tekrarda ara fazın daha temiz hale geldiğini gözlemleyebilirsiniz). Bu prosedür oldukça güvenilirdir ve DNA verimi fazladır. Bu nedenle halen laboratuvarların çoğunda kullanılmaktadır.Genomik DNA İzolasyonu: DNA’nın çöktürülmesi Alkol ve Tuz ile Çöktürme • Hacmin yarısı kadar amonyum asetat ekleyin. Neden? Etanol varlığında DNA?nın çökmesine yardımcı olur. NaCl de kullanılabilir, ya da tamamen bu basamağı atlayabilirsiniz (DNA konsantrasyonuna bağlı olarak) Tuz DNA?nın negatif yükünün nötralize olmasına yardım eder (böylece çözücü moleküllerden ayrılır- bu durumda çözücü sudur). Tuz aynı zamanda su ile etkileGime girerek DNA?nın çözünürlüğünü zayıflatır. Bu “salting out” olarak bilinir. • %100?lük etanol kullanılır. Etanol su kadar iyi bir çözücü değildir. %65?den daha çok etanol içeren çözeltilerde DNA çözünmez. Ancak etanolle çöktürmenin etkinliği çok sayıda etkene bağlıdır: sıcaklık, zaman, DNA miktarı. • Çöktürme basamağı için izopropanol de kullanılabilir. Bu çözücü için de RNA da stabil kalabilir (seçici çöktürme). Bu nedenle bazen bu amaçla da kullanılır. %50?den daha çok izopropanol varlığında DNA çökelti halinde kalır. • Cam bir pastör pipeti ya da çubuk kullanılarak DNA dikkatlice dıGarı alınır. %70 etanolle muamele edilir ve TE çözeltisi içerisinde çözülür. Cam pipet kullanmak hız kazandırır. %70 etanol yıkamasıyla ortamda bulunan fazla tuz uzaklaGtırılır. • ALTERNATGF. Bazı laboratuvarlarda DNA santrifüj edilerek çöktürülür. Bu az miktarda DNA?nın olduğu durumlarda daha etkili sonuç verir. Ancak %70 etanol ile pellet yine yıkanır ve örnek tekrar spin edilir.DNA Miktar Tayinine (Kantitasyon) Genel BakıG Niçin kantitasyon yapılır? Kantitasyon yöntemleri ? Spektrofotometre ? Slot Blot (Quantiblot) ? Microplak okuyucu ? Real Time PCR Kantitasyon, miktarın tayin edilmesidirDNA Kantitasyonu DNA izolasyonunu takiben, DNA konsantrasyonunun ve diğer maddelerin varlığının belirlenmesi amacıyla yapılır. Örneğimde ne kadar DNA var? Neden önemli? Kantitasyon ekstraksiyonun baGarısı hakkında ipucu verir. STR bölgelerinin ya da mtDNA?nın amplifikasyonu örneğin içerdiği DNA miktarından etkilenir. Kantitasyonun temel nedeni: Çoğu PCR yöntemi DNA yeterli düzeydeyse en iyi sonucu verir. DNA ekstraksiyonun çok az olması: ? DNA amplifikasyonunda baGarısızlık ? Allel drop out (tamamlanmamıG amplifikasyon) ile sonuçlanır DNA Kantitasyonu DNA ekstraksiyonunun çok fazla olması: ? Amplifiye STR pikleri ölçüm alanını aGar ? PCR inhibitörlerinin artması • DNA saflığı • Saflık belirlemede 260/280 nm sonucuna bakılır. • Saf bir DNA 260/280=1.8 olmalıdır. 260/280>1.8 ise RNA kontaminasyonu 260/280< 1.8 ise protein kontaminasyonuDNA Miktar Tayini • Spektorfotometrik okumalar: UV absorbansı kullanılarak DNA/RNA miktarı ve saflığı belirlenebilir. Halkalı yapılar UV dalga boylarını absorbe edebilir. Ancak pek çok molekül halkalı yapı içerir (nükleik asitler, proteinler, organikler, deterjanlar, lipidler, ve liste sürer...) • Hem DNA hem de RNA halkalı yapıları yaklaGık 260 nm de güçlü absorbans verir. • Proteinler, bazı amino asitler fenilalanin, triptofan ve tirozin 280 nm?de maksimum absorbans verir. • Alt çizgi tuz taneciklerinin miktarı ile iliGkilidir. Kaba hesapla, pek çok sey UV absorblar. Aynı zamanda pH?a oldukça duyarlıdır, bu nedenle sulandırmada kullanılan TE tamponu ile spektrofotometre kalibre edilmelidir. • 260nm’deki absorbansın 280nm’deki absorbansa oranıyla saflık değeri elde edilebilir • DNA = A260/A280 yaklaşık 1.8 • RNA= A260/A280 yaklaşık 2.0 • Bunlar saflaGtırma ürünleri için iyi sonuçlardır ve aynı zamanda iyi kantitasyon değerine de sahip olacaktır (OD değerlerini DNA miktarına çevirirken 260 nm?de ölçülen DNA için katsayı 50ug/ml, RNA için 40ug/ml?dir).DNA Kantitasyonu Spektrofotometre: ? DNA UV ıGığını 260nm?de absorblar ? Daha çok DNA = Daha çok absorbans ? Gnsan DNA?sına özgül değildirDNA Kantitasyonu ? DNA agaroz jelde ayrılır ? Etidyum bromür ile boyanır (çift zincirli DNA gerekli) ? Gnsan DNA?sına özgül değil Ayrıca DNA miktarını belirlemek için genellikle DNA miktarıyla iliGkili olarak yapıya bağlanan Etidyum bromür ve sybr green boyaları da kullanılır. Daha güçlü bir yöntemdir, ancak daha pahalıdır. Etidyum bromürle boyanmıG bir jelde bant yoğunlukları karGıklaGtırılarak DNA fragmentlerinin kantitasyonu yapılabilir, ölçü olarak bir marker kullanılır. DNA Kantitasyonu Mikroplak okuyucu: ? Picogreen interkalasyon yapan bir boyadır. ? Çift zincirli DNA?da baz çiftleri arasına bağlanır, floresansı arttırır. ? Floresan miktarı çözeltideki DNA miktarı ile iliGkilidir. DNA Kantitasyonu Mikroplak okuyucu: