Genetik Mühendisliğine giriş elektroforetik yontemler. Elektroforetik YöntemlerElektroforez, elektriksel bir alanda moleküllerin yüklerine, moleküler ağırlıklarına ve büyüklüklerine göre ayırt edildikleri bir tekniktir. Elektroforetik analizin temeli, moleküllerin elektriksel bir alanda jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı molekülün büyüklüğüne, yapısına, jeldeki kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.+ - Power DNA How fast will the DNA migrate? DNA büyüklüğü! *Küçük DNA büyük DNA’dan daha hızlı hareket eder small largeDestek ortamı = Jel Uygun tampon Elektroforez aygıtlarında iki temel eşitlik önemlidir. Ohm Yasası V = I.R P = I².R Volt miliamper ohm watt1-Ohm yasasına göre ,elektrik alanı,akım ile direncin çarpımına eşittir. Elektroforez aygıtında oluşan direncin hemen hemen tamamı jel tarafından oluşturulur. Direnç, akımın geçtiği bölgenin alanının ve kullanılan tamponun iyonik kuvveti ile ters orantılıdır. Belli bir akım için, jelin kalınlığının veya tamponun miktarının ve iyonik kuvvetinin azalması direnci arttırır;böylece jel boyunca oluşan voltaj derecelenmesi ve jele uygulanmış molekülün elektroforetik göç hızı artar. Elektriksel değişkenlerden mutlaka birisi sabit tutulur. Sabit akım; direnç artarsa hareket hızı düşer ama ısı açığa çıkar. Sabit voltaj; hareket hızı düşer ama yeni bir ısı oluşmaz.2-Sistemin ürettiği güç direnç ile akımın karesinin çarpımına eşittir. • Üretilen güç ısı şeklinde ortaya çıkar ve elektoforez aygıtı, jelin sıcaklığını artırmaksızın ancak belli miktarda gücü dağıtabilir. Bu nedenle voltajın üst sınırı genellikle elektroforez aygıtının ısıyı dağıtma yeteneğine bağlıdır.Yöntemde değişen, destek ortamının tipi ve konumudur.ELEKTROFOREZ YÖNTEMLERİ • Poliakrilamid Jel Elektroforezi • Agaroz Jel Elektroforezi • Değişken Alanlı (Pulsed Field ) Jel Elektroforezi • İzoelektrik Focusing • İki Boyutlu Elektroforez • Kılcal (Kapiller) Elektroforez • İmmünoelektroforezAgaroz Jel Elektroforezi Doğrusal polisakkarit 200-50000 bç (DNA ve RNA) Scanning Electron Micrograph of Agarose Gel (1 ×1 µm) ? • Polimerize olmus agaroz porlu bir yapıdır ve DNA nin hareketine olanak sağlar.AGAROZ; Tatlandırılmış agaroz jeller Uzak Doğu’da 17 yy ‘dan beri besin olarak tüketilmektedir. Agaroz biyolojide ilk kez 1882 yılında Robert Koch* tarafindan Tuberculosis bakteri uretiminde kullanilmistirGerekli Malzemeler Agaroz TBE (Tris-borat) tamponu TAE (Tris-asetat) tamponu TE tamponu Yükleme Tamponu Sükroz, bromfenol mavisi, suElektroforez Gereçleri Casting tray ? Jel tanki ? Guc kaynagi ? jel taraklari ?Gel casting tray & combsAgaroz Jelin Hazırlanması • Agaroz jeller toz haldeki agaroz ile tampon çözeltilerin uygun miktarda karıştırılması ile hazırlanır.Agarozun kaynatılması • Agaroz oda ısınsında çözünmez.• Agaroz jel 35-40 dakikada polimerize olarak kullanıma hazır hale gelir. • Dikkatlice bantlar ve tarak çıkarılarak tanka yerleştirilir.?Cathode (negative) Anode ? (positive) DNA ? ? wells ? buffer ?Yukleme orneklerinin HAzirlanmasi • 6X Loading Buffer: ? ? Bromophenol Blue ? Glycerol + DNA yada PCR urunuAgaroz jele orneklerin yuklenmesiJelin yurutulmesiCathode (-) Anode (+) DNA (-) ? ? Bromophenol Blue ? wellshttp://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/Jelin Boyanmasi • Ethidium bromide DNA ya UV isigi altinda baglanir ve bantlarin gorunur hale gecmesini saglar • Yurutmeya baslamadan once yurtme tamponuna yada jele hazirlanirken ilave edilir ***DIKKAT! Ethidium bromide oldukca guclu bir mutajen ve toksiktir kullanirken mutlaka eldiven giyilmelidirJelin boyanmasiGoruntulemeEthidium Bromide alternatifleri • ? Methylene Blue • ? BioRAD - Bio-Safe DNA Stain • Ward’s - QUIKView DNA Stain • Carolina BLU Stain • …digerleri • avantajlari • ucuz • Daha az toksik • UV isigi ihtiyaci yok • Atiklari tehlikeli degil dezavantajlari Daha az sensitive Jelde daha cok DNA ihtiyaci Uzun boyma suresiEtidyum bromürPoliakrilamid Jel Elektroforezi Doğal Jel Elektroforezi Kullanılan tamponlar, deterjan ve diğer denatüre edici maddeleri içermediği için prosedür doğal koşullarda ilerler. Denatüre Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) Polipeptidlerin ilerleme hızları, sadece elektriksel yükleri tarafından değil, aynı zamanda molekül ağırlıkları tarafından da belirlenir.% 12'lik Jelin hazırlanışı (20 ml) 8 ml Akrilamid stoğu 7.5 ml 10 x TBE pH 8.3 2 ml % 1 SDS 2.39 ml Distile su 0.1 ml % 10 APS 0.010 ml TEMED eklenir. Polimerleşme için serbest radikal oluşumuna sebep olan APS reaksiyon başlatıcı, TEMED ise katalizör olarak rol oynar. PAGE sisteminde uygulama sınırları (proteinler için) Jel yüzdesi Ayrıştırma Kapasitesi (Dalton) % 5 60.000 - 212.000 % 10 18.000 - 75.000 % 15 15.000 - 45.000 Coomassie Boyama Boya, asidik ortamda proteinlerin serbest amino gruplarına bağlanır. 450 ml Metanol 90 ml Asetik asit 450 ml Distile su 2.5 g Coomasie brilliant blue G250 ile 20 - 25°C ' da 30 dakika bekletilir. Yıkama çözeltisi değiştirilerek gece boyu yıkamaya devam edilir. Jel boyandıktan sonra çeşme suyu ile yıkanır. ardından; 450 ml Metanol 90 ml Asetik asit 450 ml H2O karışımının 200 ml'si içinde 30 dakika bekletilir. Yıkama çözeltisi değiştirilerek gece boyu yıkamaya devam edilir. Jel, % 10 gliserol çözeltisine aktarılır. Bu çözelti içinde jel hem normal boyutuna ulaşır, hem daha iyi temizlenir, hem de kırılganlığı azalır. Gümüş Boyama Gümüş, proteinlerdeki sülfidril ve karboksil gruplarına bağlanarak boyama yapar.“Pulse Field” Jel Elektroforezi 5 Mb boyutundaki DNA parçaları ayrılabilir. Moleküller belirli zaman aralıklarında birbirlerine farklı açıda iki elektriksel alan etkisinde bırakılır.Moleküler Ağırlığın Belirlenmesi Peptidlerin molekül ağırlığının logaritması ile jeldeki rölatif göç hızları (Rf değerleri) arasında doğrusal ilişki vardır. Standart polipeptidlerin Rf değerleri ordinata ve moleküler ağırlıkların log10 değerleri absise yerleştirilerek bir standart grafik hazırlanır.İKİ BOYUTLU JEL ELEKTROFOREZİ (2D-PAGE)Aynı anda bir çok proteinin analizi İki özelliğe göre ayrım yapılır İlk olarak izoelektrik noktası Sonra moleküler ağırlıkKAPİLLER ELEKTROFOREZKaynaklar • Gel Electrophoresis of Proteins, B.D.Hames • Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler, Temizkan D., Arda N. • http://www.biologyreference.com/images/biol_02_img0140.jpg • http://www.ndpteachers.org/perit/Electrophoresis%20%5B1%5D.gif • http://porpax.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/DNA_electrophoresis.jpg • http://www.marlow.com/Applications/images/Electrophoresis.jpg • http://dnareplication.csc.mrc.ac.uk/images/footprint-gel-electrophoresis-large.jpg • http://www.topac.com/electrophoresis.jpg • http://www.hood.edu/images/content/academics/instruments/Agilent_Capillary_Electrophoresis_System.JPG • http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/Gel_electrophoresis_apparatus.JPG/469px-Gel_electrophoresis_apparatus.JPG • http://farm3.static.flickr.com/2290/2088536114_aff2539f1b.jpg • http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/ca/Agarose_polymere.png • http://web.siumed.edu/~bbartholomew/images/protein_methods/gel_structure_of_agarose.gif • http://www.madsci.org/posts/archives/1999-02/919869466.Mb.1.jpg • http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/images/mainbody/punchout.Par.59943.Image.-1.-1.1.gif • http://www.medscape.com/content/2001/00/41/82/418216/art-e0706.06.fig7.jpg • http://www.piercenet.com/media/PD-Fig11.gif • http://leedsdna.info/HUGO/2004/Lab_Notes/Image206.gif • http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/flashfiles/CE.swf • http://www.hasanunal.net/resimler/ekler/68_eks.pdf • http://www.frontiersinzoology.com/content/4/1/16/figure/F2 • http://www.noble.org/2dpage/Images/CellGel-april-2003-Elmer.jpg • http://www.steve.gb.com/images/science/isoelectric_focussing.png • http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/NOTES/Protein_Properties/Fig5_21IsoelectricFoc.GIF • http://www.sci.sdsu.edu/TFrey/Bio750/Electr22.gif • http://www.msstate.edu/dept/biochemistry/faculty/willeford/4414/Lab_6_files/image006.jpg • http://www.nature.com/nprot/journal/v2/n6/images/nprot.2007.202-F5.jpg • http://www.plant.uoguelph.ca/research/homepages/raizada/Equipment/RaizadaWeb%20Equipment%20Images/11.%20miniprotean2D%20cell.jpg • http://www.expasy.org/melanie/NonDIGE%20layout4.jpg • http://www.expasy.org/melanie/ • file:///F:/doc_wtd021045.html