Genetik Mühendisliğine giriş genetik muhendisliğinde kullanılan enzimler BGY 4008 GENETGK MÜHENDGSLGĞGNE GGRGg Doç. Dr. Nurettin YÖREKDNA Manipüle Edici Enzimler DNA manipüle edici enzimler, katalizledikleri reaksiyonların tipine göre 5 ana sınıfa ayrılabilirler: 1) Nükleazlar 2) Ligazlar 3) Polimerazlar 4) Modifiye edici enzimler 5) TopoizomerazlarNükleazlar Nükleazlar bir DNA zincirinde bir nükleotidin sonraki ile bağlantısını, fosfodiester bağlarını kırarak yıkar. İki farklı tip nükleaz çeşidi vardır: 1) Ekzonükleazlar: DNA molekülünün bir ucundan bir kerede bir nükleotidi uzaklaştırır. 2) Endonükleazlar: DNA molekülünde içteki fosfodiester bağlarını kırar.Ligazlar • Hücredeki DNA ligazın işlevi, çift zincirli DNA molekülünün tek zincirde meydana gelen kırıkları tamir etmektir. • Pekçok organizmadan elde edilen DNA ligazlar çift zincirli DNA’nın iki ayrı fragmentini (3’-OH ve 5’-P) fosfodiester bağı ile birbirine bağlayabilir.Polimerazlar DNA polimerazlar, mevcut bir DNA yada RNA kalıbına komplememnter olan yeni bir zinciri sentezleyen enzimlerdir. Dört tip DNA polimeraz genetik mühendisliğinde rutin olarak kullanılmaktadır: 1-Genellikle E. coli’den elde edilen DNA polimeraz I’dir. Çoğunlukla çift zincirli bir DNA molekülünün, kısa tek zincirli bir bölgesine bağlanır ve daha sonra ilerledikçe mevcut zinciri yıkarak bütünüyle yeni bir zincir sentezler. Yani hem sentez hem de yıkım yapabilen çift aktiviteli bir enzimdir. 2- Klenow fragmenti: DNA pol I’in polimeraz ve nükleaz aktivitelerienzimin iki farklı alt birimi tarafından kontrol edilir. Nükleaz aktivitesi polipeptidin ilk 323 amino asidindedir. Bu yüzdenbu kısmın uzaklaştırılması polimeraz aktivitesi devam eden ancak DNA’yı yıkamayan modifiye bir enzim bırakır. Klenow fragmenti denen bu modifiye enzim hala tek zincirli kalıp üzerinde komplementer bir zincir sentezleyebilir, fakat nükleaz aktivitesi olmadığı için, bir kere çentik doldurulunca sentezi sürdüremez. Klenow DNA dizi analizinde kullanılır.3- Taq DNA polimeraz: Thermus aquaticus bakterisinden elde edilen ve yüksek sıcaklıklarda aktivite gösterebilen polimeraz enzimidir. 4- Revers Transkriptaz : Çeşitli virüslerin çoğalmasında görev alan bir enzimdir. Kalıp olarak DNA yerine RNA kullanır ve RNA kalıbına komplementer olan bir DNA zinciri (cDNA) sentezleme yeteneği klonlama tekniği için temeldir.DNA Modifiye Edici Enzimler • Alkalin fosfataz: (E. Coli, dana barsakdokusundan ya da karidesten) DNA molekülünün 5’ ucunda bulunan fosfat grubunu uzaklaştırır. • Polinükleotid kinaz(T4 fajıyla enfekte olmuş E coliden) Alkalin fosfatazın aksine, serbest 5’ uca fosfat grubu bağlar. • Terminal deoksinükleotidil transferaz: (dana timus dokusundan) DNA molekülünün 3’ ucuna bir yada daha fazla deoksinükleotidler ekler.Topoizomerazlar Süper kıvrımlar yaratarak yada uzaklaştırarak kovalent olarak kapalı-halkasal DNA’nın (yani plazmid moleküllerinin) konformasyonunu değiştirebilen enzimlerdir. Her ne kadar bunlar DNA replikasyonu çalışmalarında önemli ise de, genetik mühendisliğinde henüz gerçek kullanım alanını bulamamışlardır.Tanım ve Tarihçe Restriksiyon endonükleaz (RE) enzimleri, DNA dizilimlerini özgül olarak tanıyan ve dizilimlere yakın bölgelerden veya bu dizilimler içindeki spesifik bölgelerden DNA’yı kesen yapılardır.• Luria ve arkadaşları konak tarafından kontrol edilen restriksiyon modifikasyon olarak isimlendirdikleri bir olguyu 1950’li yılların başında bildirmişlerdir. Yaptıkları çalışmalarda bir bakteriyel suşta (Escherichia coli K) iyi üreyen bakteriyofajın aynı bakterinin farklı suşunda (E. coli C) zayıf bir şekilde ürediğini belirlemişlerdir. • Daha sonraki yıllarda, Arber ve Dussoix konak-kontrol restriksiyon modifikasyonunu açıklayabilmek için moleküler bir metot oluşturmuştur. Bu metotla, bazı bakteriyel suşların DNA’yı kesebilen endonükleazlara ve bu arada kendi DNA’larını koruyabilmek için ise suş-spesifik modifikasyon sistemine sahip oldukları ortaya konmuştur. • Yabancı bir DNA bakteriyi infekte ettiğinde, infektif faj DNA’sı modifiye edilmemiş bu enzimler tarafından kesilebilir. Bununla birlikte, faj DNA’sının küçük bir kısmı endonükleazlar tarafından kesilmeden önce modifiye edilebilir. Modifiye DNA başarılı bir şekilde çoğalabilmekte ve ikinci bir konağı infekte edebilmektedir. Ancak, modifiye olmuş faj DNA’sı orijinal konakta çoğalabilme yeteneğini kaybetmektedirİlk olarak, 1968’de, Arber ve Linn EcoB RE’ın nükleaz aktivitesini göstermişlerdir. Aynı yıl Meselson ve Yuan E.coli K’da benzer bir enzimi elde etmişlerdir. Daha sonraki yıllarda, bu enzimlerin Tip I RE’lar oldukları belirlenmiştir 1970’de Smith ve arkadaşları HindII’yi saflaştırıp, kesim ve tanıma bölgelerini karakterize etmişlerdir. Bu yıldan sonra pek çok RE saf olarak elde edilmiştirBinlerce sayıda olan enzimlerin isimlendirilmesi Smith ve Nathans tarafında belirlenen basit bir sisteme göre yapılmaktadır. Bu isimlendirmede, enzimin elde edildiği cinsin ilk harfi, daha sonra bakteri türünün ilk iki harfi ve en son olarak bazen soya ait bir harfle birlikte ilk izolasyondan başlayarak Romen rakamıyla enzimin izolasyon sırası belirtilir (E. coli RY 13 soyu; EcoRI). Enzimlerin isimleri, yalnızca enzimlerin orijinleri hakkında bilgi vermekte, kestiği dizilimler hakkında bilgi sağlamamaktadır RE’ların Sınıflandırılması ve Endonükleaz Özellikleri Restriksiyon endonükleazlar; • metilaz aktivitelerine, • alt unite yapılarına, • kesim özgüllüklerine ve • kofaktör ihtiyaçlarına göre, tip I , II, III ve homing endonükleazlar olarak 4 genel grupta sınıflandırılmaktadır Tip I enzimler Tip I enzimler: Hem metilasyon hem de modifikasyon yapabilen iki fonksiyonlu enzimlerdir. Metilazda 5-adenosylmethionin (adomet) kofaktör görevi görür ve metiltransferaz için metil vericisidir. Bu enzimler endonükleaz aktiviteleri için ATP, adomet ve Mg+2’ye ihtiyaç duyarlar. Tip I tarafından tanınan nükleotitler asimetriktir. Bilinen tüm tip I enzimler hedef dizilimdeki adenin residülerini metilasyona uğratmaktadır. Bu enzimler hedef dizilimlerine bağlanmalarına rağmen Kesimleri dizilim dışında tesadüfü olarak gerçekleştirmektedir. Kesim Olayında belirleyici faktör enzimin metilasyon aktivitesidir• Bu enzimler birbirine çok yakın iliGkide olan üç gen (host • specifity of DNA; hsdR, hsdM ve hsdS) tarafından kodlanan üç alt • üniteden oluGmaktadır. Bunlardan, hsdM ve hsdS aynı promotor • bölgeden transkripsiyonla sentezlenirken hsdR’nin kendi promotor bölgesi bulunmaktadır. hsdM ve hsdS tarafından sentezlenen alt • üniteler metil transferaz aktivitesi görmektedir. Son alt ünite ise • kesim aktivitesi için gerekli bulunmuGtur. hsdS alt ünitesi iki adet • hedef tanıma bölgesine sahiptir. Bu yapı hem restriksiyon hem de • metilasyon hedeflerini tanımaktadır. Tip I enzimi kesim aktivitesi için • ATP’ye ihtiyaç duymaktadır ve hsdR alt ünitesi ATP’nin hidrolizi için • aktif bölge içermektedirTip II enzimler Tip II enzimler: Biyolojik alanların hemen tamamında restriksiyon endonükleazlar terimi çoğunlukla bu tür (tip II) RE’leri için kullanılan bir terimdir. Çünkü tip II enzimleri tam hedef nükleotitten kesim yapma özellikleri nedeniyle klonlama ve moleküler biyoloji araştırmaları için ideal enzimlerdir. Tip II RE enzimleri Mg+2 iyonlarının varlığında çift iplikcikli DNA üzerindeki palindromik dizilimleri tanıyan ve bu dizilim içindeki özel bir bölgeden kesen homodimerik enzimlerdir. Moleküler biyoloji çalışmalarında değerli bir araç olmalarına ek olarak, tip II endonükleazlar, fosfodiester bağının hidroliz mekanizmasının anlaşılması ve spesifik DNA-protein ilişkisinin belirlenmesi çalışmaları için model sistemdir. Özellikle, EcoRV, PvuII, EcoRI, BamHI ve son zamanlarda daha sık kullanılan Cfr101 ve BgII gibi enzimler hidrolitik enzimlerin yapısının ve fonksiyonunun anlaşılmasında faydalı bilgiler sağlamıştır.• Tip II RE’ler kesim sonucunda DNA’da oluşturdukları uçların motiflerine göre kabaca iki alt gruba ayrılmaktadır. • Bunlardan BamHI, EcoRI ve Crf101 gibi enzimler DNA’nın 5’ ucunda yapışkan uç (sticky end) oluşturacak şekilde kesim yapar ve bunların üç boyutlu yapıları birbirlerine çok benzerdir. Bu enzimlerin oluşturduğu uçların ligasyon etkinlikleri yüksektir. Bu nedenle klonlama çalışmalarında tercih edilmektedirler. Tip II enzimlerden, EcoRV, HaeIII ve PvuII gibi enzimler ise;DNA’da küt uç oluşturacak şekilde kesim yaparlar. Bu tür uçların ligasyon etkinlikleri düşüktür. Ayrıca belirli bir enzimle kesilmiş bu uçların başka enzimle şekillenen küt uçlarla da yapışmaları mümkündür. Bu tür uçlar genellikle klonlama çalışmalarında önerilmemektedir. Ancak, bunlar özellikle DNA parçalarının ucuna bir ya da birden fazla RE tanıma bölgesi bağlamak için kullanılmaktadırlar• Gerek yapışkan uç gerekse küt uç oluşturan RE’lardan bazıları DNA üzerinde aynı dizilimleri tanıyabilmektedirler. Bunlar izoşizomerler olarak isimlendirilmektedir Örneğin; Bam HI 5’---- G/GATCC----3’ Bst I5’ ---- G/GATCC----3’ Az sayıda da olsa bazı RE’ları birden fazla tanıma ve kesme bölgelerine sahiptirler. Örneğin; Hind II 5’-----GTC/AAC---3’ 5’-----GTT/AAC---3’ 5’-----GTT/GAC---3 5’-----GTC/GAC---3’Tip III enzimler Tip III enzimler: Tip I’ler gibi bunlar da metilasyon ve modifikasyon yapabilen çok fonksiyonlu enzimlerdir ve ATP’ye bağlı kesim gerçekleştirmektedirler. Bu enzimler DNA’ya tanıma bölgelerinden bağlanmalarına rağmen kesimi farklı bölgeden ve rastgele yapmaktadır. Kesim tanıma bölgesine yakın bir konumda gerçekleştirilmektedir. Bu nedenle tip III enzimler klonlamada kullanılmamaktadır Homing endonükleazlar Homing endonükleazlar: Diğer restriksiyon enzimlere kıyasla iyi derecede korunmuş ve benzerlik gösteren protein yapılarına (LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H, Ile-Cys) sahip, uzun (12-40 baz çifti) ve asimetrik bölgeleri tanıyıp kesen, aktivitesi için protein ve RNA’ya ihtiyaç duyan enzim grubudur. Diğer RE’lerden farklı olarak, bunlar daha az tanıma özgüllüğü göstermekte ve tanıma bölgelerindeki tek baz değişimini tolere edebilmektedirler. Bu enzimler, en son belirlenen restriksiyon enzim gruplarıdır ve DNA’nın yeniden yapılanmasında fonksiyonel oldukları bilinmektedir. Tüm biyolojik sistemlerde (bakteri, ökaryot, alg) bulunmaktadırlarRestriksiyon Endonükleaz Enzimlerinin Yapısı ve DNA’ya Bağlanma Mekanizmaları Homing endonükleazlar hariç, mevcut RE’lerin amino asit dizilimleri kıyaslandığında, aralarında çok az amino asit benzerliği olduğu gösterilmiştir. Ancak, Tip II enzimlerin primer dizilimleri benzememesine rağmen tersiyer yapılarının benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. Restriksiyon endonükleazlar, çift sarmal DNA’ya tanıma bölgelerinden bağlanabildikleri gibi tanıma bölgeleri dışından da bağlanmaktadırlar. Tanıma bölgeleri dışına bağlandıktan sonra, bu enzimler çizgisel DNA boyunca kaymaktadırlar. Bu işlem esnasında DNA ile enzim arasını su molekülleri doldurmaktadır. Enzim tanıma bölgeleri bulunduğu zaman su moleküllerinin pek çoğu uzaklaştırılmaktadır. Örneğin EcoRI enzimi tanıma bölgesine geldiği zaman yaklaşık 50 molekül su ortaya çıkarılmaktadır. Genel olarak özgül tanıma bölgelerine yakın olan 2-3 adet nükleotit, enzimin bağlanması için gerekli bulunmaktadır. Spesifik kompleks formunda hem enzimde hem de bu dizilimlerde konformasyonal değişiklikler meydana gelmektedir Tanıma bölgelerine bağlanan enzimlerin kristal yapıları kullanılarak DNA’nın kesilme mekanizmaları ortaya konmuştur. Çalışılan pek çok enzimde elde edilen veriler kesimi katalize eden bir substratın varlığına işaret etmektedir. Bu modellerde kesilme bölgesinde korunmuş amino asitler ve bunlara bağlanmış olan Mg+2 iyonlarının bulunduğu gösterilmiştir. Hidroliz ise aktive olmuş bir su molekülünün nükleofilik atağıyla başlamaktadır.Star Aktivitesi Restriksiyon endonükleazların özellikleri üzerine yapılan çalışmalar, bunların çok ilginç özelliklere sahip olduklarını ortaya koymuştur. Özelliklerin en dikkate değer olanı, bu enzimlerin optimal şartlarda özgül DNA’yı en yakın dizilimden ayırt edebilme başarılarının, optimal olmayan şartlarda oldukça değişmesidir. Örneğin, EcoRI enziminin tanıma bölgesi (5’-GAATTC-3’)’ne bağlanma oranı en yakın tanıma bölgesi (5’-TAATTC)’ne kıyasla 105 kat daha fazladır. Ancak, enzim için optimal olmayan şartlar altında oran oldukça değişmekte ve pek çok enzim için bu Durum söz konusu olmaktadır. Benzer bölgeleri kesme işlemine, bir enzimin star aktivitesi denilmektedir. Bu durum moleküler biyoloji çalışmalarında oldukça önemli olmakta ve çalışmanın başarısında belirleyici konuma yükselebilmektedir. Bu nedenle kullanılan enzimlerin star aktiviteye sahip olup olmadıkları bilinmelidir. Enzimlerin star aktivitelerini artıran parametrelerin en önemlileri pH, Mg+2, metal iyonlarının varlığı (özellikle Mn+2), gliserol ve etanol gibi maddelerin bulunması ve kesilen DNA ile enzim oranı arasındaki ilişkidir. Yukarıda belirtilen parametrelerin star aktivitesine etkileri bir kaç mekanizmayla açıklanabilmektedir. Bunlardan biri özgül olmayan bağlanma esnasında RE’leri ile DNA arasında bulunan su moleküllerinin fazlalığıdır. Bu ise katalizi etkilemektedir. Örneğin, alkali pH’da artan OH- iyonlarının kesim esnasında kullanılan suya olan ihtiyacı azaltıcı etkisi, katalizi etkilemektedirRestriksiyon Endonükleazların Tepkime Şartları Restriksiyon endonükleazlar gerek uzun süreli saklamada gerekse Aktivite göstermede farklı koşullara gereksinim duymaktadırlar. Bir enzimden en iyi şekilde yararlanabilmek için üretici firma tarafında bu şartlar kullanıcıya iletilmektedir. Enzimlerin aktivitesini etkileyen faktörlerin bazıları; ısı, pH, enzim kofaktörleri, tuz konsantrasyonu, iyon varlığı ve stabilizatör maddelerdirReaksiyon şartları PH: Pek çok RE pH 7.2 -8.5 arasında aktiftir.Mn+2: Ticari olarak mevcut RE’ler kofaktör olarak yalnızca Mg+2’ye ihtiyaç duymaktadır. Reaksiyon şartlarında özellikle Mn+2 varlığı enzimin star aktivitesini ortaya çıkarmaktadır. Tuz konsantrasyonu: RE’lerin pek çoğu 50-150 mM NaCl yada KCl ortamında kesim yaparken bazı enzimler için 20 mM’dan fazla tuz konsantrasyonu enzimin etkinliğini ortadan kaldırmaktadır. Bovin serum albumin (BSA): Enzimin stabilitesini sağlamak amacıyla saklama ve çalışma tamponu içerisinde BSA bulundurulmaktadır. BSA ile enzim; proteaz, spesifik olmayan adsorbsiyon ve ısı gibi çevresel zararlardan korunmaktadır. Gliserol: RE’ler – 20°C’de saklanırken saklama tamponu içerisine gliserol katılmaktadır. Bu tedbir enzimin donmasını engellemektedir. Böylece enzimin dondurulup çözdürülmesi esnasında göreceği zarar azaltılmaktadır. Pek çok enzim için son konsantrasyonda %5’ten fazla gliserol, enzimin star Aktivitesine sebep olmaktadır. Ancak, bazı enzimlerin %10 gibi yüksek gliserol konsantrasyonunda da normal kesim yaptıkları ortaya konmuşturGnkübasyon ısısı: Pek çok RE maksimum aktivitesini 37°C’de göstermektedir. Genel olarak bu enzimlerin inkübasyon ısıları orijin aldıkları bakterinin üreme özelliklerini yansıtmaktadır. Bu Nedenle enzimlerin farklı ısı ihtiyaçları bulunmaktadır. DNA konsantrasyonu: Substrat olarak kullanılan DNA’nın miktarı RE kesimini etkilemektedir. Az bir hacim içinde çok miktarda DNA bulunması, enzimin difuzyonunu engellemekte ve etkinliğini büyük ölçüde düGürmektedir. Oldukça düGük DNA konsantrasyonları da enzim tarafından kesimin Verimini etkilemektedir