1 - Histoloji - Embriyoloji Histokimya, Mikrop Çeşitleri ve Hücreye Genel Bakış HİSTOKİMYA, MİKROSKOP ÇEŞİTLERİ VE HÜCREYE GENEL BAKIŞ Doç.Dr.Mehmet Fatih SÖNMEZ 2 ÖĞRENİM HEDEFLERİ • Dönem I öğrencileri bu dersin sonunda; – Histokimyasal boyamaları – İmmunohistokimya’yı – Mikroskop çeşitlerini – Klasik ışık mikroskop özelliklerini – Hücrenin genel yapısını öğrenecektir. 3 • Histokimyasal maddeler aracılığı ile doku içindeki kimyasal maddelerin yerleşimini araştıran histokimya, histolojinin bir alt koludur. • Hücre ve dokuların, özel boyaları belirli bölgelerinde tutma özelliği, yapılarında yer alan kimyasal maddelerin varlığı ile mümkündür. • Organik ve inorganik maddelerin gösterilebilmesi, kimyasal maddelerin ve enzimatik aktivitelerinin belirlenebilmesi için kullanılan histokimyasal reaksiyonların uygun ve sonuçlarının anlamlı olması gerekir. 4 (1) analiz edilen maddeler orijinal yerinden uzaklaştırılmamalıdır (2) Reaksiyon sonucunda oluşan ürün çözünmemeli (3) Renkli ya da elektron dağıtıcı olmalıdır (4) Kullanılan yöntem çalışılan kimyasal maddeye uygun olmalıdır (5) İşlem sonunda reaktif gruplar denatüre olmamalıdır. 5 • Histokimyasal yöntemlerle hücre ve dokulardaki organik ve inorganik maddeler gösterilebilmektedir. • Bunlara örnek olarak; – Demir – Fosfat – Lipid – Karbonhidrat – Nükleik asitler 6 Demir • Doku içi inorganik maddelerin gösterilmesine örnek olarak ferric iyonlar (Fe 3+) içeren doku kesitleri kullanılabilir. • Doku kesitleri, potasyum ferrosiyanid ve hidroklorik asit karışımı içinde inkübe edilirse potasyum ferrosiyanid dokudaki ferrik iyonlarla reaksiyona girer ve dokuda, suda erimeyen koyu mavi ferrik ferrosiyanid çözeltisi oluşur. • Bu reaksiyona Prusya mavisi reaksiyonu (Perl reaksiyonu) adı verilir. • Bu yöntemle demirin hücre içi yerleşimi gösterilebilir ve demir birikimi ile kendini gösteren (akdeniz anemisinde dalakta demir birikmesi gibi) hastalıkların teşhisi sağlanabilir. 7 8 Fosfat • Kemik dokusunda büyük miktarlarda bulunan kalsiyum fosfat vücutta en bol olan ve erimeyen fosfattır. • Fosfatların gösterilmesinde gümüş nitrat reaksiyonu kullanılır. • Gümüş nitrat, kalsiyum fosfatla reaksiyona girdikten sonra gümüş fosfat oluşur; bu, hidrokinonla indirgenince sonuçta siyah bir çökelti oluşur. • Bu reaksiyon, kemik çalışmalarında ve kemik gelişiminin incelenmesinde sıklıkla kullanılır. 9 10 Lipit • Lipidler hücre içinde ya mikroskobik damlacıklar şeklinde veya diğer hücre elemanlarına tutunmuş halde bulunurlar. • İnceleme sırasında serbest lipid damlacıkları eriyecekleri için alkol, aseton ve ksilen gibi yağ eriticilerine maruz bırakılmamalıdır. • Lipid çalışmaları için frozen kesitler kullanılmalıdır. • Diğer doku bileşiklerine kuvvetli bağlanma özelliği gösteren lipidler fiksasyondan sonra rutin olarak gömülürse Sudan black, oil red, Nil blue sülfat, osmium tetroksit ile gösterilebilirler. 11 12 • PERİODİK ASİT-SCHİFF REAKSİYONU (PAS) • PAS glikojen gibi doku karbonhidratlarının gösterilmesinde kullanılan bir tekniktir. • Örneğin sindirim ve solunum sistemlerindeki goblet hücreleri (sol şekil), kıkırdak matriksi ve böbrek tübüllerinin epitel hücrelerinin mikrovillus-ları (fırçamsı kenar) ve bazal membranları (sağ şekil) PAS (+) olarak adlandırılan menekşe renginde boyanırlar. 13 METİL GREEN PYRONİN • Nükleik asitlerin DNA ve RNA olmak üzere iki tipi vardır. Bunlar özel enzim histokimyası ile gösterilebilirler. • DNA Feulgen reaksiyonu ile gösterilebilirken, metil green pyronin ile hem DNA hem de RNA gösterilebilmektedir. • Bu reaksiyon ile, plazma hücrelerinin sitoplazmaları ile nukleolusu (RNA içeren bölgeler) kırmızı, DNA yeşil renkte boyanmaktadır. 14 15 Enzim Histokimyası • Enzimlerin hücre içinde gösterilmesi için sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. • İncelenecek doku, belirli bir substrat ile vücut ısısında inkübe edilecek olursa, enzim ile substratın reaksiyonu sonucu oluşan ürün renkli bir maddeye dönüşür. • Buna en iyi örnek alkalen fosfat reaksiyonudur. Doku, gliserofosfat ve kalsiyum iyonları içeren bir tampon solusyonunda inkübe edilirse, fosforik asit ayrılarak kalsiyum iyonları ile birleşir. • Oluşan kalsiyum fosfat renksizdir, kesitler kobalt klorür ve amonyum sülfür ile işleme sokulursa, dokulardaki alkelen fosfatazın bulunduğu bölgelerde kobalt sülfür siyah renkte çökelti halinde belirir. 16 Plasentada alkalen fosfataz reaksiyonu 17 İmmunohistokimya • Histokimyanın oldukça özel bir dalıdır. Bu teknik, organizmanın yabancı proteinlere karşı reaksiyon verme özelliğine dayanır. • Eğer yabancı bir madde (antijen) bir canlıya enjekte edilirse, bu maddeye karşı organizma antikor üretir. • Antikor özel olarak antijen ile reaksiyona girer ve antijeni zararsız hale getirir. • Antijen ve antikor arasındaki bu reaksiyon immunohistokimyanın temelini oluşturur. • Polikolonal ve monoklonal antikorlar bulunmaktadır. 18 19 Karaciğerde HbsAg Midede ghrelin 20 HÜCRE VE DOKU KÜLTÜRLERİ • Organizmadan ayrılmış hücre ve dokuların vücut dışında (in vitro) yaşatılmasını sağlayan yöntemdir. • Organizmadan alınan küçük doku parçaları yaşamaya elverişli ısıda (vücut ısısı) kültür ortamına yerleştirilir. • Kültür ortamı için en çok fizyolojik eriyiklerde sulandırılmış kan plazması ve embriyonel doku sıvısı kullanılır. • Bu teknik ile organların gelişimini etkileyen faktörler incelenebilir. 21 22 Hücre kısımlarını ayırma 23 Mikroskop • Çıplak gözle görülemeyecek kadar küçük cisimlerin birkaç çeşit mercek yardımıyla büyütülerek görüntüsünün incelenmesini sağlayan bir alettir. • Öncelikle adından da anlaşılacağı üzere, mikro, yani çok küçük hücrelerin incelenmesinin yanı sıra, sanayi, genetik, jeoloji, arkeoloji ve kriminoloji adli bilimler alanında da büyük hizmetler görmektedir. 24 • Mikroskobu, ilk önce Hollandalı Zacharias Janssen'in, 1590 dolaylarında bir teleskobu tadil etmek suretiyle meydana getirdiği kabul edilmektedir. • Ancak bu sıralarda başka Hollandalı, Alman, İngiliz ve İtalyan bilginleri de, mercek sistemi tersine çevrilmiş bir teleskobun, cisimleri büyütmek için kullanılabileceğinin farkına varmışlardır. • Bugünkü mikroskobun ana prensiplerini ise 17. asırda Hollandalı Anton van Leeuwenhoek ve İngiliz Robert Hooke bulmuşlardır. 25 26 • Biyolojik materyalleri incelemek için bir kaç tip mikroskop kullanılmaktadır. • Bunlar esas olarak kullanılan ışık kaynağının tipine göre sınıflandırılır. • En yaygın olarak kullanılan, görülen ışığın kullanıldığı ışık mikroskoplardır. • Bu tipe; – Aydınlık saha, – Karanlık saha, – İnterferens, – Faz-kontrast, – Polarizasyon mikroskopları dahildir. 27 • Görülmeyen ışık kaynağının kullanıldığı mikroskoplar ise; – Ultraviyole ışınlarının kullanıldığı • Ultraviyole • Fluoressan mikroskoplar, – Elektron ışınlarının kullanıldığı • Transmission Elektron Mikroskop (TEM) • Skaning Elektron Mikroskop (SEM) – Lazer ışınlarının kullanıldığı • Konfokal mikroskop 28 MİKROSKOP ÇEŞİTLERİ Ayırım gücü -Işık mikroskobu -Klasik mikroskop 1.0-0.2 mikron -İmmersiyon mikroskobu 0.5-0.1 mikron -Faz kontrast mikroskobu 0.5-0.1 mikron -İnterferans mikroskobu 0.5-0.1 mikron -Ultraviole mikroskobu 0.5-0.1 mikron -Floresan mikroskobu 0.5-0.1 mikron -Polarizasyon mikroskobu 0.5-0.1 mikron -Karanlık saha mikroskobu 0.5-0.1 mikron -X ışınları mikroskobu 0.5-0.1 mikron -Elektron mikroskobu 2.0-20 angstrom -Transmisyon elektron mikroskobu -Scanning elektron mikroskobu 29 • Mekanik kısımlar – (a). Ayak, – (b). Tabla, sehpa, – (c). Kolon (tüp), – (d). Revolver (objektifleri taşıyan döndüren parça) – (e). Vidalar: makrovida ve mikrovida, – (f). Diafram, – (g). Ayna. • Optik parçalar; üç mercek sisteminden meydana gelir. – (a) Kondansör, – (b) Objektif, – (c) Oküler (Projektör). Aydınlık saha ışık mikroskobu: Mekanik ve optik kısımlardan oluşur. 30 31 • Mikroskopta ayrıntılı net bir görüntü elde edilmesini sağlayan en önemli etken, iki parçacığın ayrı nesneler olarak görülebildiği en küçük mesafe anlamına gelen çözümleme gücü’ dür (rezolüsyon). • Işık mikroskoplarının en yüksek çözümleme gücü yaklaşık olarak 0.2 µ dır; bu özellik 1000-1500 kez büyütmede iyi görüntü sağlar. • Bir mikroskobun çözümleme gücü objektifinin kalitesine bağlıdır. • Kaliteli mikroskoplarda renk (kromatik) ve mercek yüzey eğimi (sferik) sapmaları kusursuza yakın düzeltilmiş bulunur. 32 Karanlık Alan Mikroskopu • Aydınlık alan mikroskobunun sehpası altındaki kondansörü özel karanlık alan kondansörüyle değiştirildiğinde karanlık alan mikroskobuna dönüşür. • Bu durumda ışık kaynağından gelen ışın demetlerinin bütününün objektife erişmesi kondansör tarafından önlenir. • Kondansörün geçirdiği ince ışın demetleri az kontrasta sahip ufak doku parçacıkları ya da bakteri ve spiroketlere çarpıp yansıyarak karanlık zeminde parlak görüntülerin elde edilmesini sağlar (karanlık alan incelemesi). 33 34 Faz Kontrast Mikroskobu • 1942 yılında kullanılmaya başlanmıştır. • Canlı hücrelerin doğrudan incelenmesini sağlayan ışık mikroskopudur. • Herhangi bir boyanmamış hücre ve doku örneğinde farklı komponentlerin birbirinden ayırt edilmesine imkan tanır. • Aydınlık alan mikroskobu kondensör ve objektif merceklerine yerleştirilen açıklığı halka biçimindeki özel bir diafram ve objektif faz plağı, bu mikroskopları faz kontrast mikroskobuna dönüştürür. • Bu düzen yardımıyla, dokuya gelen ışın demetlerinin kırılmaları doğrudan göze gelenlere kıyasla geciktirilerek, kontrast oluşturulur. • Doku içi elemanları arasındaki ışın demetlerini yansıtma farklılıkları parlaklık değişiklikleri olarak göz tarafından daha iyi algılanır 35 36 Polarizasyon mikroskobu • Işık mikroskobuna kondensör merceğin alt kısmına yerleşik polarizer ve objektif ile oküler arasına yerleşik analizer isimli iki mercek eklenmiştir. • Polarizasyon merceği ışın demetlerini dokuya erişmeden önce belirli bir düzlem üzerine süzerken, analizer dokudan geçen polarize ışın demetinin uğradığı kırılma değişimlerini saptar. • Polarizasyon mikroskobunda bakılan tespit edilmiş boyasız hücrelerin moleküler düzeyindeki yapıları hakkında bilgi edinilir. • Hücre içi mikroflamanlar ve kristaloid proteinlerinin asimetrik yapılanmış olanlarının ışık kırıcılığı her yanda eşitsizdir, polarize ışığı çift kırarak karanlık zemin üzerinde parlak yapılar olarak çevrelerinden ayırt edilirler (anizotropi). • Hücre içindeki simetrik yapılı proteinlerin ışık kırıcılığı her yönde eşit olduğundan polarize ışığı ayırmazlar ve siyah alanlar şeklinde kalırlar (izotropi). 37 38 Floresan mikroskobu • Ultraviyole ışınları kullanılır. • Doku kesit örneklerindeki bazı elemanlar bu ışığı emerek dalga boyları kendi kimyasal bileşimlerine bağlı olarak gözle görülebilen daha uzun dalga boyunda fluoresan ışınları yayarlar. • Bunlar primer fluoresan ya da otofluoresan olarak bilinirler. • A vitamini, porfirinler ve klorofil bu şekilde davranırlar. • Sekonder olarak dokulardaki fluoresan özelliği ortaya çıkarmak amacıyla ortama flurokrom olarak adlandırılan boyalar, antibiyotikler gibi maddeler ilave edilmektedir. 39 40 Konfokal Mikroskop • Konfokal mikroskop ya da konfokal lazer skaning mikroskop hücrede ya mevcut olan ya da hücre içine eklenmiş olan floresan molekülleri lazer kullanarak ortaya çıkarır. • Yayılan floresan imaj floresan mikroskop tarafından büyütülür ve detektör tarafından ölçülür. • Dedektörün önü sadece lens boyunca fokal bir noktadan gelen ışıkların geçmesine izin veren iğne deliği şeklindedir. • Sonuç olarak dedektöre ulaşan bütün ışıklar fokuslanır. • Konvansiyonel mikroskopta eğer tüm alan düz olmazsa ışığın çoğu fokuslanamaz ve imaj bulanık olur. • İmaj oluşturmak için laser ışınları aynalar yardımıyla örneği çapraz olarak tarar bu yüzden tarayıcı konfokal mikroskop denir. • Işınlar bilgisayar da toplanmayana kadar görüntü oluşmaz. • Kalın örneklerin farklı tabakalarından gelen imajlar bilgisayarda üç boyutlu olarak yeniden inşa edilebilir. 41 42 Transmisyon Elektron Mikroskobu • İncelenen örneklerin görüntüleri elektron ışınlarıyla elde edilir. • Elektron titreşimleri manyetik merceklerden geçip, yönlendirilerek fluoresan ekran üzerinde görüntü elde edilir. • Elektronların kaynağı olan katod yüksek ısıya dayanıklı ince bir metal flamandır (tungsten). • Katoda yüksek gerilimde elektrik akımı verilir, gerilim arttıkça katoddan yayılan elektron titreşimlerinin dalga boyu küçülür, mikroskobun çözüm gücü artar. 43 • Elektron mikroskobu incelemeleri sonucunda trilaminar ünit zar yapısı açıklandı. • Çekirdeğin tek değil çift ünit zarla çevrili olduğu görüldü. • Golgi kompleksininin ayrıntılı yapısı belirlendi. • Endoplazmik retikulumun granüllü ve granülsüz türleri tanımlandı. • Lizozomlar ve peroksizomlar elektron mikroskobunun ortaya çıkardığı hücre organelleri oldular. • Mitokondriyonlardaki bağımsız nükleoprotein molekül iplikçikleri gösterildi. 44 45 Tarayıcı (Scanning) Elektron Mikroskobu • Hücre, doku ve organların yüzeylerini üç boyutlu bir şekilde görüntülenmesini sağlar. • Görüntüyü oluşturan ince elektron demeti doku örneğinin yüzeyini aralıklarla tarayarak elektron yaymalarına neden olur. • Her bir noktada, birincil (primer) elektron demeti, incelenen materyalin atomları ile etkileşerek ikincil (sekonder) elektronların geri yansımasını arttırır. • Yüzeyin yükseklikleri daha çok, alçak alanları ise daha az sekonder elektronları ortaya çıkardığı için, farklı derinlikte bir görünüm elde edilir. • Böyece sekonder elektronlar yüzeyin üç boyutlu bir görüntüsünün oluşmasını sağlar. • Tarayıcı elektron mikroskobunun noktalar arası çözüm gücü 100 A 0 kadardır. 46 HÜCREYE GENEL BAKIŞ 48 • Protoplasma (Protos=ilk ve Plasma=oluşum) • Canlı maddenin özel organizasyonu ile hücreler oluşur. • Doğadaki canlılar tek veya çok hücrelidirler. • Benzer yapısal özellikleri olan hücre toplulukları doku olarak tanımlanmaktadır. • Dokuların biraraya gelmesi ile de organlar oluşur. 49 • Hücrenin varlığı, mikroskobun bulunması ile tanınmaya başlanmıştır. • İlk olarak 1665 de Robert Hook ''sellula = hücre'' adını vermiştir. • ''mikrografia'‘ • Anton von Leeuwenhoek 1672 yılında çeşitli hücre tiplerini (spermatozoonları, çizgili kas hücrelerini, lökositleri, bakterileri). • Robert Brown, Schleiden ve Schwann 50 • Prokaryotik; hücre zarı bulunmasına karşılık çekirdek zarı yoktur. • Ayrıca membranlı organelleri bulunmaz • DNA’larına bağlanacak özel proteinleri (Histon) içermezler. 51 • Ökaryotik hücre; çekirdek sitoplazma içinde zarla çevrilidir • Sitoplazma içinde zarla çevrili olan ve olmayan çeşitli organeller bulunur • Histon proteinleri DNA’ları bağlar 52 Hücrenin şekli • İnsan vücudu ortalama 75 trilyon hücreden oluşmuştur. • Hücrelerin şekli, – oluşturdukları dokuların durumlarına, – komşu hücrelerin konumuna, – görevleri – bulundukları safhalara göre değişebilir. • Zigottan sonra oluşan hücrelerin (blastomer) bütününü yuvarlak veya yuvarlağa yakındır. • Gelişme ilerledikçe ve komşu hücrelerin basıncı artınca blastomerlerin şekilleri çok yüzlü (polihedral) olur. 53 • Hücrelerin şekilleri; – sitoplazmanın akıcılığı, – yüzey gerilimleri, – komşu hücrelerin birbiri üzerine yaptığı basınç, – hücre zarının duyarlılığı – görevleri ile ilgili olarak değişiklik gösterir. 54 1.Yuvarlak (küremsi) hücre: Dişi germ hücresi (ovum), 2. Kübik hücre: Tiroid bezi tek katlı follikül hücreleri, 3. İğsi (fuziform) hücre: Düz kas hücresi 4.Yıldızsı biçimli hücre: Mezenşimal hücre, 5. Silindirik veya yüksek boylu prizmatik hücre: İnce barsak örtücü epitel hücresi, 6. Piramidal hücre: Beyin korteksindeki motor ve medulla spinalis ön boynuz hücreleri, 7. Armutsu hücre: Beyincikte Purkinje hücresi, 8.Yassı hücre: Endotel hücresi, 9. Şekli değişebilen hücreler: Lökosit, makrofaj. 55 56 57 58 59 Hücre büyüklüğü • Vücut büyüklüğüne bağımlı değildir. • Fil ve fare • 3- 200 µm • 200-1500 µ 3 • Organizmadaki en küçük hücreler sinir sisteminde bulunur. • Kanın beyaz hücrelerinden lenfositler 5-6 µm, trombositler 2-4 µm, sinir hücreleri (nöronlar) gövdeleri 3-140 µm büyüklük gösterirler. • Ovum 200 µm 60 61 62 Hücrelerin kimyasal yapısı • Hücrelerin görevleri ile ilgili olarak bazı kimyasal farklılıklara sahip olmalarına rağmen bütün hücreler genelde ortak bir kimyasal yapı gösterirler. • O, H, C, N, P, S. • Hücrelerin kimyasal yapısını – anorganik maddeler (su, anyon ve katyonlar), – organik maddeler (protein, nukleprotein, karbonhidrat ve lipidler) – özel fonksiyonlu organik maddeler (enzim, hormon, vitamin ve pigment) oluşturur. 63 -Su (%70-85, %4.5’u bağlı su) -Anyon ve katyonlar (%1) potasyum, magnezyum, fosfat, sülfat, bikarbonat, sodyum klorür, kalsiyum -Proteinler (%10-20) Yapı proteinleri filamanlar, mikrotübüller, myofilamanlar, fibriller Globuler proteinler enzimler, hormonlar, albumin, hemoglobin, tripsin Nukleoproteinler RNA, DNA -Karbonhidratlar (%1) Monosakkarit trioz, pentoz (riboz, deoksiriboz), heksoz (glukoz) Disakkarit sakkaroz, maltoz, laktoz Polisakkarit nişasta, glikojen -Lipidler (%2-3) 64 Hücrelerin işlevleri • Uyarılabilme • İletim a- Endokrin Haberleşme b- Parakrin Haberleşme c- Sinaptik Haberleşme d- Jukstakrin Haberleşme • Kasılma • Solunum • İçine alma • Dışa boşalma • Salgılama 65 HİSTOLOJİ KAYNAK KİTAPLARI •Temel Histoloji Yener Aytekin •Histoloji ve Hücre Biyolojisi Ramazan Demir •Histoloji I ve II Türkan Erbengi •Genel Tıp Histolojisi Meral Tekelioğlu •Özel Histoloji Meral Tekelioğlu •A Textbook of Histology Bloom, Fawcett •Basic Histology Junqueira, Carneiro, •Human Histology Stevens, Lowe •Histology, A Text and Atlas Ross, Romrell •Genel histoloji, özel histoloji Mukaddes Eşrefoğlu 66