1 - Histoloji - Embriyoloji Histolojiye Giriş HİSTOLOJİYE GİRİŞ Doç.Dr.Mehmet Fatih SÖNMEZ 2 ÖĞRENİM HEDEFLERİ • Dönem I öğrencileri bu dersin sonunda; – Türkiyede’ki histoloji eğitiminin tarihini – Histoloji ve Embriyolojinin ilgi alanlarını – Doku takip yöntemlerini öğrenecektir. 3 • Ülkemizde histoloji terimi embriyoloji ile birlikte,Histoloji ve Embriyoloji adı altında kullanılmaktadır. • Histoloji, histos (doku) ve logia (bilim) kelimelerin birleşmesiyle türemiştir. • Dilimizdeki karşılığı Doku Bilimi’ dir. • İlm-i Ensaç veya Fenn-i Ensaç • Embriyoloji, embrio (cenin) ve logia kelimelerinden oluşmuştur. • Türkçemizdeki karşılığı ise, Cenin (dölet) Bilimi’dir. • Mebhas-ül Cenin 4 • Türkiyede çağdaş tıp eğitim-öğretimi 1827. • 1839 yılında “Mekteb-i Tıbbiye-i Adliyye-, Şahane” (kısaca Mekteb-i Tıbbiye) kurulmuştur. • Okulun ilk yıllarında histoloji bağımsız bir ders değildir, anatomi dersi ile birlikte anlatılmaktadır. • 1872 yılında histoloji dersi anatomiden ayrılarak “ilm-i Ensac-ı Hucreviyye” adıyla bağımsız ders olarak anlatılmıştır. 5 • Histolojinin ilk öğretim üyesi Mirliva Dr. Mehmet Saib Paşa’dır. • 1872 de yurtdışına doktora eğitimi için gönderilen hekimlerden Miralay Dr.Haydar Kamil Efendi İlm-i Ensac eğitimi için Viyana’ya gitmiştir. • Dr.Tevfik Recep embriyoloji alanında ilk doktora yapan öğretim üyesidir. • 1982 yılında morfoloji, 1993 yılında Histoloji- Embriyoloji Anabilim Dalı olarak ayrılmıştır. 6 • Histoloji bilimine, mikroskopik anatomi de denmektedir. • Histoloji biliminde, bir mikroskop yardımıyla biyolojik materyal ve yapılar incelenir. • Histoloji hücre, doku ve organ bilimi olduğuna göre, bunların yapılarının yanı sıra işlevlerini de ele alacaktır. • Bu yüzden, histoloji sadece yapıyı tanımlamakla kalmaz, aynı zamanda biyokimya, moleküler biyoloji ve fizyoloji arasında bağlantılar kurar ve hastalık ile ilgili patogenezde önemli rol oynar. 7 • Histoloji = Doku bilimi Histomorfoloji: Doku ve hücrelerin mikroskobik yapısını inceler. Histofizyoloji : Hücre ve dokulardaki canlılık olaylarını araştırır. Histokimya : Doku ve hücrelerdeki kimyasal maddelerin hücre içi yerleşimini özel boyama maddeleri ile girdiği reaksiyona bağlı olarak gösterilmesini sağlar. Sitoloji : Hücrelerin yapısını ve işleyişini inceleyen bilim dalı. 8 IŞIK VE ELEKTRON MİKROSKOPİDE KULLANILAN ÖLÇÜ BİRİMLERİ Mikrometre (mikron) (µm) = 0.001 mm = 10 -6 m Nanometre (nm) = 0.001 µm = 10 -9 m Agström (A o ) = 0.1 nm = 10 -10 m 9 • Doku ve organların mikroskop altında incelenebilir hale getirilmesi için yapılan tüm işlemlere histolojik teknik veya mikroteknik adı verilir. • Histolojik teknikler A- Vital inceleme B- Ölü dokuların incelenmesi şeklinde olmak üzere iki şekilde yapılır. HİSTOLOJİK TEKNİK 10 • Canlı, yaşamakta olan hücre veya organizmalar üzerinde, canlıyı öldürmeksizin yapılan incelemeye vital inceleme denir. • Histolojide kullanılan vital boyalar Asit boyalar : Tripan mavisi Çini mürekkebi Lityum karmin.................Fagositik hücreler Bazik boyalar: Metilen mavisi Toluidin mavisi................Sinir hücreleri Janus green .....................mitokondrion Nötral kırmızı Krezil viole .......................vakuol sistemi Dahlia viole ......................Nukleus VİTAL İNCELEME 11 • Ana gereç ? Mikroskop • Materyaller, mikroskopta incelenmeden önce, aşağıda belirtildiği şekilde elde edilir: • İğne Biyopsisi: Beyin, göz, tiroid, lenf düğümü, meme, akciğer ve plevra, böbrek, kemik ve kemik iliği, testis ve iskelet kası. • Endoskopik Biyopsi: Solunum yolu, mide ve barsak yolu, üriner sistem yolu. • Transvasküler Biyopsi: Kalp ve karaciğer • Doğrudan Çıkarım Biyopsisi: Deri, ağız, larinks ve serviks uteri. • Kürete Biyopsisi: Uterus endometriyumu. Histolojik İnceleme Nasıl Yapılır ? 12 1.Tespit (fixation) 2.Yıkama 3.Sudan kurtarma (Dehydratation) 4.Şeffaflandırma (Clearing) 5.Gömme (Embedding) 6.Kesit alma (Sectioning) 7.Boyama (Staining) 8.Kapatma (Mounting) • Bir doku parçasının canlıdan alınıp parafin bloklama yapılıncaya geçen işlemlerin tümüne DOKU TAKİBİ denir PARAFİN TEKNİĞİ 13 • Amacı; 1-Hücre ve dokuların canlı hale en yakın biçimde muhafaza etmektir. Ancak bu tam gerçekleştirilemez. 2-Otolizi, bakteriyel bozuma ve çürümeyi önlemek. 3-Kolaylıkla diffüzyon olan maddelerin kaybını önlemek. 4-Sağlığa zararlı kötü etkilere karşı dokuyu kuvvetlendirmek. 5-Dokunun boyalarla ve diğer reaktiflerle boyanmasını kolaylaştırmak. • Fiziksel; ısı, kurutma, dondurma • Kimyasal; immersiyon, perfüzyon TESPİT (FİKSASYON) 14 1-Ölümden ve operasyondan sonra alınan örnekler hemen fiksatife atılmalıdır. 2-Fiksatifde kullanılan kimyasallar taze olmalı, titizlikle tartılmalı ve karıştırılmalıdır. 3-Doku parçaları mümkün olduğu kadar küçük olmalıdır. 4-Fiksatif, doku hacminin en az 10 katı, formalin için 20 katı olmalıdır. 5-+4 0 C’de fiksasyon önerilir. Düşük ısılar fiksatifin dokuya işleyişini azaltırsa da otolizi önlediğinden doku iyi tespit edilir. 6-İçi boş organlar tespit çözeltisi ile doldurulmalıdır. Böylece tespit çözeltisi dokuya her iki yüzden işler ve iç yüzün düzgün yüzey şekli korunmuş olur. Başarılı Fiksasyon İçin Nelere Dikkat Edilmelidir? 15 7-Kaba önce fiksatif konmalı, parçalar sonra daldırılmalıdır. Yoksa dokular kaba yapışır ve yapışma yerinden tespit çözeltisi dokuya işlemez. 8-Yağdan ve havadan zengin dokular tespit çözeltisinde yüzdükleri için kaset içine alınarak tespit çözeltisine batması sağlanmalıdır. 9-Tespit çözeltisinin dokuya işleyişini hızlandıran işlemlerden kaçınmalıdır. Yüksek ısı tespit çözeltisinin dokuya işleyişini hızlandırırken aynı zamanda otolizi de hızlandırır. 10-Kullanılan tespit çözeltisinin dokulara işleme hızı bilinmelidir. 16 11-Tespit çözeltisi ne hipotonik ne de hipertonik olmalıdır. Osmolaritesi canlı dokunun osmolaritesi (300 mosl) ve ölü dokudakine (450 mosl) uygun olmalıdır. Tespit edilmeyen doku su ile kesinlikle yıkanmamalıdır. 12-Tespit çözeltisinin pH’sı dokunun pH’sına yakın olmalıdır (pH=6-8). Bu nedenle tamponlanmış formalinle dokuların tespit edilmesi daha uygun olur. 13-Fiksasyonda kullanılan kaplar dar boğazlı olmamalı, düz hatlı olmalıdır. 14-Doku çok sertleşmemelidir. Doku aşırı derecede sertleşirse kesit alımı zorlanır. 17 Tespit ajanları • Sıvı Tespit Ajanları – Absolu etil alkol – Soğuk aseton – Formaldehit – Gluteraldehit – Trikloroasetik asit – Asetik asit • Katı Tespit Ajanları – Osmiyum tetroksit – Pikrik Asit – Kromik Asit – Potasyumdikromat – Civa Klorür 18 % 10’luk formol: 25ml formol + 75 ml distile su. Bouin: suda doymuş pikrik asit…………….15 ml Formol………………………………….…5 ml Asetik asit…………………………….…1 ml Müller eriyiği: potasyum bikromat…………………..2,5 gr Sodium sülfat……………………….1 gr Distile su…………………………….100 ml Orth karışımı: 9 kısım müller eriyiği + 1 kısım formol Zenker : müller eriyiği………………………………100 ml Civa biklorür ……………………………… 5 gr Aseti asit…………………………………….5 ml Helly: müller eriyiği…………………………………100 ml Civa biklorür ………………………………..5 gr Formol………………………………………..5 ml Maximow: müller eriyiği…………………………100 ml Civa biklorür ………………………………..5 gr Formol………………………………………10 ml 19 • Uygulanan tespit çeşidine göre yapılır. • Su veya değişik yoğunluklarda alkol kullanılır. • Formol, osmiyum tetraoksit ve krom tuzu içeren tespitlerden sonra, yıkama aşamasında su kullanılır. • Pikrik asitle gerçekleştirilen tespitler den sonra, % 70 – 80’lik alkol ile yıkama yapılabilir. Yıkama 20 • Parafine gömülecek olan dokuların, yıkamadan sonra içerisinde hiç su kalmaması gerekir. • Bu amaçla, en yaygın olarak etil alkol kullanılır. Etanol, dokulardaki suyu çeker. • Dokular, sırayla artan derecelerde alkol serisinden geçirilir. Sudan Kurtarma (Dehidretasyon) 21 • Şeffaflaştırmanın temel amacı, dokuya nüfuz etmiş olan alkolün yerine, ışığı kırma endeksi daha yüksek olan bir sıvı ayıracın konmasını sağlamaktır. • Ksilol, bu amaçla en yaygın olarak kullanılan ve nispeten daha ucuz olan bir maddedir. • Benzen, toluen, karbon sulfit, kloroform veya propilen oksit Şeffaflandırma (Clearing) 22 23 • Dokulardan istenilen kalınlıkta kesitlerin elde edilebilmesi, bunlara sert bir kıvam veren gömme maddesi içine yerleştirilmesiyle sağlanır. • Parafin. • Epoksi resinler (epon, araldit, vestopal) Gömme (Embedding) 24 • Emdirme maddesinin içine gömülerek homojen biçimde sertleşmiş olan blok kitlesi (doku ve emdirme maddesi), mikrotom adı verilen özel bir aletle kesilir • Bunların günlük pratikte en çok kullanılanları ise, kızaklı veya rotatif (dönerli) mikrotom tipleridir. • Ayrıca, çok pahalı olan elmas uçlu bıçaklar da kullanılmaktadır. Mikrotomlarda, (tiplerine göre) 1 – 10 mikron kalınlığında kesitler alınır. Kesit alma 25 26 27 • Doku elemanlarının genellikle birbirine yakın ışığı kırma indilerine sahip olmaları ve kesitlerin parafinle infiltre olmalarından dolayı ışık mikroskobunda incelenemezler. • Dokuların farklı elemanlarının incelenebilmeleri boyanmaları ile mümkündür. • Boyama işleminde önce, lam üzerine alınmış kesitlerdeki parafin ksilen ile uzaklaştırılır, azalan alkol serilerinde dokular rehidrate (yeniden su ile doyurulma) edildikten sonra boyamaya tabi tutulur. Boyama 28 • Asidofili: Bazik yapıdaki bir doku yapısının asit bir boya ile boyanması özelliğine asidofili denir. Eozin bir asit boyadır; sitoplazmayı pembe-kırmızıya boyar (eozinofili). • Bazofili: Asit yapıdaki bir doku yapısının bazik bir boya ile boyanması özelliğine bazofili denir, çekirdeği mavi- mor renge boyar. • Monokromazi: Doku yapısının boyanın gerçek renginde boyanması özelliği • Metakromazi: Bir doku yapısının kullanılan boya solusyonunun renginden farklı bir renge boyanmasına denir. Boyanma Özellikleri 29 30 • Hematoksilen ve Eozin (H-E) • Periodik Asit-Schiff (PAS) reaksiyonu • Masson trikrom • Alcian blue • Van Gieson • Retikülin boyası • Azan • Giemsa • Toluidin blue…..vs.. Histolojide sık kullanılan boyalar 31 • HEMATOKSİLEN-EOZİN NUKLEUS Heterokromatin - mavi Ökromatin - negatif Nukleolus - mavi SİTOPLAZMA Ergastoplazma - mavi Genel sitoplazma - pembe-kırmızı Filamanalr - pembe-kırmızı HÜCRE DIŞI YAPILAR Kollagen lifler - pembe Elastik lifler - pembe Retiküler lifler - pembe Graund substans- mavi Kemik matriksi - pembe Bazal membran - pembe 32 • PERİODİK ASİT-SCHİFF REAKSİYONU (PAS) • PAS glikojen gibi doku karbonhidratlarının gösterilmesinde kullanılan bir tekniktir. • Örneğin sindirim ve solunum sistemlerindeki goblet hücreleri (sol şekil), kıkırdak matriksi ve böbrek tübüllerinin epitel hücrelerinin mikrovillus-ları (fırçamsı kenar) ve bazal membranları (sağ şekil) PAS (+) olarak adlandırılan menekşe renginde boyanırlar. 33 • MASSON TRİKROM • Üç farklı boyanın kullanıldığı bu teknik ile bağ dokusunun boyanması sağlanır. Sonuçta: – Nukleus: mavi – Bazofilik yapılar: mavi – Sitoplazma: kırmızı – Kas hücreleri: kırmızı – Eritrositler: kırmızı – Bağ dokusu: mavi veya yeşil 34 35 • GİEMSA VEYA WRİGHT • Bunlar kan ve kemik iliği yaymalarının boyanmasında sıklıkla kullanılan yöntemlerdir. • Nukleus: kırmızı-menekşe • Sitoplazma: soluk mavi • Eritrositler: soluk pembe boyanır. 36 • TOLUİDİN BLUE • Bazik bir boyadır. • Asidik doku yapılarını mavinin değişik tonlarında boyar. • Elektron mikroskobu için hazırlanmış ve rezine gömülmüş yarı ince doku kesitlerinin boyanmasında sıklıkla kullanılır. • Bazı doku yapılarını metakromatik olarak boyar. 37 • Alcian blue • Asit mukopolisakkaritleri ve glikozaminoglikanları maviye boyar. • Van Gieson: • Bağ dokusunu boyama tekniklerinden biridir; – kollageni kırmızıya, – nukleusu maviye, – eritrosit ve sitoplazmayı sarıya boyar. • Bir elastik boyası ile kombine edildiğinde elastin mavi-siyaha boyanır. • Bu boyama teknigi özellikle kan damarları ve deri için faydalıdır. 38 HİSTOLOJİ KAYNAK KİTAPLARI •Temel Histoloji Yener Aytekin •Histoloji ve Hücre Biyolojisi Ramazan Demir •Histoloji I ve II Türkan Erbengi •Genel Tıp Histolojisi Meral Tekelioğlu •Özel Histoloji Meral Tekelioğlu •A Textbook of Histology Bloom, Fawcett •Basic Histology Junqueira, Carneiro, •Human Histology Stevens, Lowe •Histology, A Text and Atlas Ross, Romrell •Genel histoloji, özel histoloji Mukaddes Eşrefoğlu 39