1 - Tıbbi Mikrobiyoloji Hücre Bağışıklığın Temelleri H ü cresel Ba ğ ş kl ğ n ö l çü m temelleri Prof . Dr. A. Nedret KO Ç Erciyes Ü niversitesi T p Fak ü ltesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal , Kayseriİ mmunoloji Canl lar n yabanc maddelere reaksiyon • verme halini inceleyen bilim dal Bu reaksiyon: Ba ğ ş kl k yan t •Ba ğ ş k sistem G ö revi: V ü cut i ç in yabanc y tan mak ve • ortadan kald rmak Humoral ba ğ ş k yan t:Antirkorlar n arac • oldu ğu H ü cresel ba ğ ş k yan t:T h ü crelerinin arac • oldu ğuİ mmun Sistem H ü creleri • • İ mmun sistem h ü creleri: Lenfoid h ü crelerdir • Hemopoetik k ö k h ü creden (HSC) k ö ken • al rlar. • HSC embrioda ilk 2-3 haftada vitellus • kesesinde yap l r. • Daha sonra KC e ta ş n r ve 6 ay hemopoez • KC de yap l r. • 6. Aydan sonra K İ ne ta ş n r do ğ umdan • sonra K İ de yap m s ü rer. KC de hemopoez yoktur. • Patolojik ko şullarda tekrar ba şlar • (ekstramed ü ller hemopoez)Lenfoid H ü creler • • T-lenfositler • • B-lenfositler • • Makrofajlar • • Dendritik h ü creler • • NK h ü creleri •Ba ğ ş k sistemi organlar Santral lenfoid organlar : Kemik ili ği, • Timus, Periferik lenfoid organlar : Dalak, Lenf • nodlar , Mukozal lenfoid doku (MALT,BALT)T lenfositler • • H ü cresel immuniteyi sa ğ layan h ü crelerdir • • K İ ’den k ö ken alan immatur ö nc ü ler timusta • olgunla ş r • Periferik kandaki lenfositlerin %60-70’i T • lenfosittir. Lenf nodunda parakortikal b ö lgede, dalakta periretioler lokalizedirler.? T lenfositleri di ğ er lenfositlerden ay rmak ? i ç in eskiden ER (eritrosit rozeti) testi kullan l rd . Koyun eritrositlerinin T h ü crelerinin ç evresinde rozet olu şturmas na dayan rd . Bu g ü n bu rozet formasyonunun sebebinin T h ü creler ü st ü ndeki CD 2 molek ü llerine koyun eritrositlerindeki LFA 3 molek ü l ü n ü n ba ğ lanmas oldu ğ unu biliyoruz. ? G ü n ü m ü zde ise TCR gen yeniden ? d ü zenlenmelerinin molek ü ler y ö ntemlerle g ö sterilmesi T h ü cre k ö kenini g ö stermektedir ? Veya y ü zey belirleyicilerine kar ş ablarla T ? h ü creleri tan n r• Her bir T h ü cresinde antijen spesifik, spesifik • bir antijeni tan yan T h ü cre resept ö r ü (TCR) bulunur. • T h ü creleri B h ü creleri gibi çö z ü n ü r • antijenlerle uyar lamaz. T h ü crelerin uyar labilmesi i ç in i şlemden ge ç mi ş membrana ba ğ l antijenlerin antijen sunan h ü crelerce T h ü crelerine sunulmas gerekir• TCR 1 ve TCR 2 olmak ü zere 2 TCR • tan mlanm ş t r. • TCR 2 alfa ve beta, TCR 1 gamma ve • delta zincirlerinden olu şur. • TCR ü CD3 molek ü l ü ile kompleks • halinde bulunur. • Kandaki T h ü crelerin % 95 i TCR2 • eksprese eder.TCR 1 h ü creler • • Mat ü r T h ü crelerin az bir k sm n olu şturur. • • Solunum sistemi mukozas ve • gastrointestinal trakt gibi epitelyal y ü zeylerde lokalizedir • Tam fonksiyonlar bilinmemektedir • • CD4 ve CD8 molek ü lleri yoktur. Az say da • h ü crenin CD8+ oldu ğ u d üşü n ü lmektedirNK-T h ü creleri • • Az miktarda TCR yan s ra NK • h ü crelerde bulunan belirleyicileri eksprese ederler • Fonksiyonlar bilinmemektedir •T h ü creleri ayr ca fonksiyonlar yla ilgili • polimorfizim g ö stermeyen CD4, CD8, CD2, integrinler ve CD28 gibi molek ü ller eksprese ederTCR 2 h ü creler • • Bu h ü creler iki gruba ayr l r • 1-Th (T helper)(%60): İ mmun cevap • olu ş turulmas n sa ğ larlar. Y ü zeylerinde CD4 molek ü l ü ta ş rlar. 2-Tc (T sitotoksik)(%30): H ü creleri eritirler. • Y ü zeylerinde CD8 molek ü l ü ta ş rlar. • T h ü creler antijenleri antijen sunan h ü crelerin • MHC ne ba ğ l olduklar takdirde tan rlar. • CD4 + T h ü creleri antijenleri MHC s n f II, • CD8 + T h ü creleri MHC s n f I ile birlikte tan r.• T h ü crelerin aktive olabilmesi i ç in iki uyar • gerekmektedir. Birinci uyar TCR uygun MHC- ba ğ l antijenle birle şti ğ inde ger ç ekle şir. İ kinci uyar T h ü crelerindeki CD28 molek ü l ü n ü n antijen sunan h ü crelerdeki B7-1 (CD80) veya B7-2 (CD86) etkile şmesi ile olur. • İ kinci uyar olmad ğ takdirde T h ü cresi yan t • veremez.Aktive olan T h ü creleri lokal etkili • proteinler olan sitokinleri salar, antijen spesifik T h ü creleri ç o ğ al r, bunlardan efekt ö r h ü creler ve haf za h ü creleri geli şirCD4 H ü creler • • CD4+ T h ü creler di ğ er T h ü creleri, B • h ü creleri, makrofaj ve NK h ü crelerin fonksiyonlar n n salg lad klar sitokinlerle d ü zenlerler. • Sitokin profillerine g ö re iki tip CD+4 • helper h ü cre vard r.• T-helper-1 (TH1): IL-2, interferon-(IFN- •) sekrete eder. Gecikmi ş tip a ş r duyarl l k, makrofaj aktivasyonu, IgG2a gibi opsonizasyon ve kompleman fikzasyonunda rol alan ablar n sentezinin uyar lmas n sa ğ larlar• T-helper-2 (TH2): IL-4,IL-5,IL-13 • sekrete eder. • TH2 di ğ er ablar n sal n m na yard m • eder (IL-4, IL-13 › IgE).CD8 h ü creler • • Sitotoksik ve supressor olmak ü zere iki • alt grubu vard r.B lenfositler • • Kemik ili ğ inde immat ü r ö nc ü lerden k ö ken al r • • Dola ş mdaki lenfositlerin %10-20’sini • olu ş turur • Lenf nodu, dalak, tonsil ve gastrointestinal • trakt gibi organlarda da bulunur ve lenfoid follik ü l olu ştururlar • B h ü creleri antijenleri B-h ü cre antijen • resept ö r ü kompleksi ile tan r• B h ü cre y ü zeyindeki IgM ve IgD B-h ü cre • resept ö r kompleksinin antijen ba ğ layan komponentini olu şturur. • B h ü cre antijen resept ö r kompleksi Igve • Igproteinleri de i ç erir. • B h ü cre resept ö rlerinin de antijen spesifitesi • vard r. • CD20 ve CD 22 + tirler. Aktivasyon g ö steren • B h ü crelerinde CD23 ve 25 bulunur. • B h ü creler Class II MHC bulundururlar • • B h ü cre fonksiyonu i ç in gerekli ba şka • molek ü ller de eksprese ederler. • Kompleman resept ö rleri, Fc resept ö rleri, CD • 40 • B lenfositleri protein yap s nda olan ve • olmayan antijenler uyar r, ab sekrete eden plazma h ü crelerine d ö n üşü rler • Sekrete edilen ablar mukozal sekresyon ve • kana kar ş p antijenleri bulup n ö tralize ederler • B lenfositler CD4+ T h ü creler ile etkile şimi • sonucu mat ü re olur ve IgG,IgA ve IgE sekrete ederlerMakrofajlar • • Myeloid seriye ait kanda dola şan • monositlerin dokuya yerle şmi ş halidir. • Kapiller endoteli, KC Kupffer h ü creleri, • alveoler makrofajlar, glomer ü l mezangial h ü creleri, serozal makrofajlar, serebral mikroglia, dalak sin ü s makrofajlar , lenf nodlar n n sin ü s endotel ve makrofajlar dokuya yerle ş en monositlerdir.? Makrofajlar ç ok say da y ü zey resept ö r ü ? i ç erirler. Bunlar ö ld ü rme, opsonizasyon ve fagositozda rol oynarlar. Class II MHC i ç erirler ve T h ü crelerine antijen sunarlar. • Hem h ü cresel hem de humoral imm ü nitede • rol al rlar • Makrofajlar n fonksiyonlar 1- iltihap ve ate ş 2- • lenfosit aktivasyonu immun cevap geli şimi, 3- doku reorganizasyonu, 4- doku hasar , 5- mikrobisidal etki 6- t ü m ö risidal etkiDentritik H ü creler • • K İ k ö kenli h ü crelerdir • • Dentritik morfolojili, fonksiyonlar farkl • iki tip h ü cre vard r. 1- ” Interdigitating ” dentritik h ü creler • (dentritik h ü creler) 2-Follik ü ler dentritik h ü creler •• Dentritik h ü creler: Antijen sunan en ö nemli • h ü crelerdir. • MHC II eksprese ederler • • CD4+ T h ü creleri antijen sunmak ve aktive • etmek i ç in gerekli t ü m ö zelliklere sahiptirler • Derideki Langerhans h ü creleri, lenf • nodundaki parakortikal zonda T h ü crelerine antijen sunan h ü creler bu gruptand r• Follik ü ler dentritik h ü creler: Dalak ve lenf • nodundaki lenfoid follik ü llerde bulunurlar • IgG i ç in Fc resept ö rleri ve kompleman • resept ö rleri vard r. • B h ü crelerine antijen sunarlar ve antijene en • y ü ksek afinitesi olan B h ü creleri se ç ip humoral imm ü nitenin kalitesini art r rlar • AIDS patogenezinde de rol al rlar •NK( “ natural killer ” ) h ü creleri • • Periferik kandaki lenfositlerin %10-15’ini • olu ş turur • T h ü cre resept ö r ü ve y ü zey Ig’i ta ş mazlar • • K İ orijinlidirler • • K üçü k lenfositlerden biraz daha iridirler ve • az ü rofilik gran ü l i ç erirler. Bu nedenle b ü y ü k gran ü ler lenfositte denir.• Daha ö nce sensitize edilmeden t ü m ö r • h ü creleri, vir ü sle infekte h ü creler ve baz normal h ü creleri ortadan kald rma yetene ğ ine sahiptir • CD16 ve CD56+ • • IFN-, TNF, GM-CSF gibi sitokinleri de • sekrete ederler • Aktivitesi aktive ve inhibe eden resept ö rlerce • d ü zenlenir. İ nhibit ö r resept ö rler organizmaya ait MHC I molek ü lleri tan r ve NK h ü cre aktivitesi inhibe edilir(t ü m n ü kleuslu h ü creler MHC I’+dir)S İ TOK İ NLER • • İ mmun sistemin mesajc molek ü lleridirler. • • İ mmun cevaplar n ba şlat lmas ve • d ü zenlenmesi lenfositler, monositler, n ö trofiller ve endotel h ü creleri aras ndaki etkile şimler sonucu olu şur. Bu etkile şim bu h ü crelerin sald ğ k sa s ü reli etkili solulbl mediat ö rler yani sitokinler ile ger ç ekle ştirilir. • Sitokinlerin etkileri ç ok ç e şitlidir ve bir ç ok • farkl h ü cre tipi taraf ndan yap l rlar. Sitokinlerin ö zellikleri • • Bir sitokin pek ç ok farkl h ü cre tipi taraf ndan • yap labilir. Ö rne ğ in TNF alfa ve IL1 hemen hemen her h ü cre taraf ndan yap l r. • Sitokinler birden ç ok tipte h ü creyi • etkileyebilirler ve etkiler farkl olabilir. Ö r: IL2 T, B ve NK h ü creleri i ç in b ü y ü me ve diferansiyasyon fakt ö r ü d ü r. • Etkilerini 3 yolla yaparlar:a) otokrin etki : bir • h ü crenin yapt ğ sitokin ayn gruptan h ü creler ü zerine etkilidir. Ö r: aktive T h ü crelerinin yapt ğ IL2 T lenfositler i ç in b ü y ü me ve diferansiyasyon etkisi yapar. b) parakrin etki: bir h ü cre grubunun yapt ğ bir sitokin ba ş ka tip bir h ü cre grubunu etkiler. Ö r: KI stromal h ü crelerinin yapt ğ IL7 B h ü cre progenitorlar na diferansiyasyon fakt ö r ü d ü r. c) endokrin etki : baz sitokinler pek ç ok h ü creyi sistemik olarak etkilerler. Ö r: IL1 ve TNF alfa inflamasyonun akut faz nda yap l rlar ve pek ç ok h ü creyi etkilerler. • Sitokinler etkilerini hedef h ü crelerdeki y ü ksek • afinite resept ö rlerine ba ğ lanarak yaparlar.Sitokinler 5 grupta incelenir: • • 1-Do ğ al imm ü niteden sorumlu olanlar: IL- • 1, TNF, tip 1 interferon, IL-6. Interferon 1 viral infeksiyonlara kar ş korur, di ğ erleri iltihabi cevab ba şlat rlar • 2-Lenfosit ç o ğ almas , aktivasyon ve • diferansiasyonunu d ü zenleyenler: IL-2, IL-4, IL-12, IL-15, TGF-.IL-2,IL-4,IL-12 T h ü creleri ü zerinde etkilidir. IL-15 NK h ü crelerin ç o ğ alma ve aktivitesini stim ü le eder.TGF-imm ü n yan t bask lar. • 3- İ nflamatuar h ü creleri aktive eden • sitokinler: IF-makrofajlar, IL-5 eozinofiller, TNF ve TNF-n ö trofil ve endotel ü zerinde etkilidir. • 4-Lokosit hareketlerini etkileyenler • (kemokinler): Yap sal olarak iki gruba ayr l r. T h ü crelerinin yapt ğ C-C kemokinler(monosit kemotaktik proteinler, monosit inflamatuvar proteinler),aktive makrofajlar n ve doku h ü crelerinin yapt ğ C-X-C kemokinler (IL-8) • 5-Hemotopoezi stim ü le eden sitokinler: • Lenfositler ve stromal h ü creler taraf ndan yap l rlar.GM-CSF, G-CSF bu sitokinlerdendir.Histokompatibilite antijenleri • • MHC (major histokompatibilite kompleksi) ilk • olarak l ö kositlerde tespit edilmi şler ve ö nceleri HLA (human leukocyte antigen) kompleksi olarak adland r lm şlard r. HLA sistemi olduk ç a polimorfiktir ve organ transplantasyonunda en ö nemli engeli te şkil etmektedirler. • Histokompatibilte antijenlerinin ba şl ca • fonksiyonu antijen spesifik T h ü crelerine antijen sunmakt r • Bir bireyin h ü crelerini toplumdaki di ğ er • bireylerden ay rt etmeye yarayan immunolojik belirleyicilerdir. • İ nsanda MHC kodlayan genler 6 nolu • kromozomda lokalizedir • Kimyasal yap , doku da ğ l m ve • fonksiyonlar na g ö re MHC gen ü r ü nleri 3 grupta toplan r • Class I ve Class II genler h ü cre y ü zey • glikoproteinlerini, Class III genler ise kompleman komponentlerini kodlar. • Class I antijenler t ü m nukleuslu h ü crelerde • ve trombositlerde eksprese edilirler. HLA-A, HLA-B, HLA-C gen lokuslar nda kodlan rlar. Ç ok polimorfiktirler. Ç ok farkl pek ç ok antijene ba ğ lan rlar. H ü cre i ç ine al nan antijen MHC molek ü l ü ne ba ğ lanarak CD8 T h ü crelerine sunulur. Virus enfeksiyonlar n n iyile şmesinde ç ok ö nemlidir. • Class II antigenler HLA-D b ö lgesinde • kodlan rlar. Subgruplar HLA-DP, HLA-DQ ve HLA-DR dir. • Class II antijenler antijen sunan h ü crelere • s n rl d r (Makrofaj, dendritik h ü creler, B h.). Fakat IFN ile aktive edilebilen endotel h ü creleri, fibroblast gibi baz h ü creler de bu molek ü lleri eksprese etmeye y ö nlendirilebilir. • Class II MHC h ü cre d ş mikroorganizmalar • ve çö z ü nebilir antijenleri CD4 T h ü crelerine sunarlar. • Antijen sunumunda CD4+T • h ü crelerininfonksiyonel ö zellikleri ö nemlidir • Aktif CD4+h ü creler, periferik lenfoid • organlarda dentritik h ü crelerin sundu ğ u antijenleri tan r • Diferansiye CD4+yard mc T h ü creler, • makrofajlar aktive ederek fagosite edilmi ş h ü cre d ş mikroorganizmalar n eliminasyonunu sa ğ lar • Diferansiye CD4+h ü creler, B h ü crelerini • aktive ederek antikorlar n yard m yla h ü cre d ş miroorganizmalar n eliminasyonunu sa ğ lar.Klasik Olmayan MHC Genleri • • S n f I B ö lgesinde: • • MHC-G • • MHC-E • • S n f II B ö lgesinde: • • MHC-DM • • MHC-DO • MHC Polimorfizimi • • Polimorfizim: Bir populasyonda bir lokustaki • allellik varyasyonlar n derecesidir • MHC allellerinin polimorfizimi peptid ba ğ lay c • yar ğ n i ç inde ve ç evresindeki amino asit rezid ü lerinde yer al r • Her bir allelik formun peptid ba ğ lay c • ö zellikleri kendine ö zg ü d ü r • Populasyonda ç ok say da allelik formlar • vard r • MHC polimorfizimi sayesinde T h ü crelerine • sunulabilen antijenik peptidlerin say s artar • B ö ylece daha ö nce kar ş la ş lmam ş yeni • antijenleri sunma olas l ğ artar ve b ö ylece toplumun ya şam n s ü rd ü rm üş olmas sa ğ lan rMHC Hastal k İ li şkisi • • Farkl bireylerin infeksiy ö z hastal klara diren ç • g ö sterme yetene ğ indeki farkl l klar belirli MHC allelerinin varl ğ ile ili şkilidir • Ö r: Baz HLA allelerinin az g ö r ü ld ü ğ ü • populasyonlarda malaryadan ö l ü m daha fazlad r • Baz HLA tiplerinin baz hastal klara e şlik • etti ğ i g ö r ü lmektedir. • Bu hastal klar inflamatuar hastal klar, • metabolik bozukluklar ve otoimm ü n hastal klar olmak ü zere 3 grupta toplanabilirler. • Ö r: Ankilozan spondilit: HLA-B27 + bireylerde • 90 kez daha s k g ö r ü l ü r • Romatoid artrit: HLA-DR3 • • Kronik aktif hepatit: HLA-DR3 • • Herediter hemokromatozis (HLA-A) • • Tip I DM: HLA-DR3 ve 4 • İ mmun Sistem Lenfopoez, IL-3 ve SCF ile yap l r. Evrimini tamamlayan olgun lenfositler istirahat halinde perifere ç kmay bekler. Perifere ç kan bakir lenfositler dalak, lenf nodu ve tonsiller gibi periferik organlara g öç ederler. Bakir lenfositlerin ö mr ü birka ç g ü nd ü r. Antijenik uyar y ald ktan sonra h ü crelerin bir k sm effekt ö r h .e d ö ner. Bir k s m h. de bellek h. e d ö n üşü r. H ü cresel immun cevap * Yabanc MHC Ag lerini ta ş yan h ü crelerin ö ld ü r ü lmesinde ( vir ü sler gibi h ü cre i ç i m. org. lerin yok edilmesi ve allograft n rejeksiyonu) ve malign t ü m ö rlerde t ü m ö r spesifik Ag leri ta ş yan h ü crelerin yok edilmesinde rol oynar. T ü m immun cevaplar n olu ş mas i ç in CD4+ h ü crenin aktivasyonu gerekir. Bunu takiben de B lenfosit ve sitotoksik T lenfositler aktive olur. T h. Ag ile ilk kez kar ş la ş nca; 1. MHC-Ag kompleksi ile TCR aras nda etkile ş im olur. 2. ASH de kostim ü lat ö r molek ü ller olmal d r. E ğer bu ikincil sinyaller olmazsa, T h. E Ag sunumu immun cevaps zl k(tolerans) ile sonlan r. En iyi bilinen ASH deki B7 ailesidir. Bu mol. T h. deki CD28 ve CTLA-4 ’ e ba ğlan r.Adezyon mol. ile CD2 aras ndaki ba ğlanmalar ve IL-1,Il-6 gibi sitokinler de kostim ü lat ö r g ö revine sahiptir.Humoral immun cevap Humoral cevap, B lenfositlerden olu ş an plasma h ü crelerince yap lan antikorlar (Ab) taraf ndan olu ş turulur. Humoral cevap, B lenfositlerin Ag ile kar ş la ş mas ile ba ş lar. * İ lk sinyal : B lenfositler y ü zeylerinde Ag resept ö r ü olarak i ş g ö ren membran IgM veya IgD mol. ta ş rlar. Ag lerin bu resept ö rlere ba ğlanmas B lenfositlerin uyar m i ç in bir sinyaldir. İ kinci sinyal : • Th lenfositlerle temas ve bunlardan sal nan sitokinlerdir. IL-2, IL-4, IL- 5, IL-6 B lenfositin proliferasyonunu art r r. Ayr ca, Ab lar n izotip de ği ş imi de sitokinlerce sa ğlan r. IL-4, Ig E sentezini sa ğlarken INF- gamma IgG2a, IL-5 ve TGF-beta IgA yap m n sa ğlar.H Ü CRESEL IMMUN CEVAP Ö L ÇÜ M • Y Ö NTEMLERI •T ve B Lenfosit sayimi • •Lenfosit aktivasyon testleri • •Makrofaj g öçü ö nlenim testi • •N ö trofil fonksiyon testleri • •Ge ç tip asri duyarlilik testleri •T lenfosit sayimi • T lenfosit sayimi i ç in E rozet testi • kullanilmaktadir.Insan T lenfositlerinde koyun eritrositlerine karsi CD2 resept ö rleri bulunmakta ve bu • resept ö rler ile koyun eritrositlerilenfositlere rozet seklinde baglanmaktadir. •B lenfosit sayimi • B lenfositlerin y ü zeyinde Immunoglobulin • resept ö rleri bulunmakta ve bunlar anti-Ig antikorlari ile kolayca baglanmaktadir. Tesbit edilen • lenfositler ü zerine fluorescein isothiocynate ile isaretli anti-Ig serumu konur. Direk immunofloresan • y ö ntemi ile boyanan B lenfositlerin sayimi, U-V floresan mikroskopta yapilir. •Lenfosit aktivasyon testleri • •Lenfoblast transformasyon testi • •Karisik lenfosit k ü lt ü r ü • •Lenfositotoksik test • N ö trofil fonksiyon testleri • •Opsono sitofajik test • •Eritrosit ambesopt ö r kompleman testi (EAC) • •Nitroblue tetrazolium testi •III-H Ü CRESEL İ MMUN İ TE Ö L ÇÜ M Y Ö NTEMLER İ H Ü CRESEL İ MMUN İ TEYE • Y Ö NEL İ K TEST Y Ö NTEMLER İ ? İ K İ BA Ş LIK ALTINDA İ NCELEN İ R İ NV İ TRO TEST Y Ö NTEMLER İ ? İ NV İ VO TEST Y Ö NTEMLER İ ?A) İ NV İ TRO TEST Y Ö NTEMLER İ 1)L Ö KOS İ T SAYIM VE FENOT İ PLEMES İ L Ö KOS İ T SAYIMI • ? Mikroskopik y ö ntemlerle ? Hemositometrik h ü cre say m ? I ş k mikroskobu (40 ’ l k) ? Thoma ve Neabaur lamlar ? %0.4 ’ l ü k tripan mavisi ¦ Rutinde Pek kullan lm yor ? Geli ş mi ş immuno hemotolojik cihazlar ? En uygun y ö ntemdir ? Piyasada farkl firma cihazlar varL Ö KOS İ T FENOT İ PLEMES İ • ? V ü cudun de ği ş ik b ö lgelerinde ? Kemik ili ği, kan, dalak ve lenf nod ü llerinde ? L ö kositlerin say ve tipleri ¦ Lenfositlerin ? B lenfositleri ? T lenfositleri ? T4 ve T8 ¦ Monositlerin ¦ Gran ü lositlerin ? N ö trofiller ? Bazofiller ? Eozinofiller ? İ mmuno hematolojik cihazlar, ? Flowsitometrik cihazlarla ? H ü cre y ü zey molek ü llerinin (Marker) fenotiplemesi ? CD (cluster of differntiation – farkl la ş ma k ü meleri) antijenleri ? Hematopoetik h ü crelerin y ü zeyinde yer al rlar ? 250 ’ ye yak n CD tan mlanm ş t r ¦ Ö rne ğin CD4 T, CD8 T, CD45 B lenfosit gibi ? L ö kositlerin y ü zeyindeki CD antijenik epitoplar ¦ Monoklonal antikorlar n (MAbs) ? Fluoresan boyalar ? Enzimlerle konjuge edilerek ? Fluoresan mikroskobuyla ? Flow sitometri cihazlar yla( EN SIK) * Kantitatif analizi ve * H ü cre ayr m ve tan mlamas yap l rFLOWS İ TOMETR İ Ç ALI Ş MA PRENS İ B İ ; Fluoresanlanm ş (FITC ile) M Ab ile i ş aretlenmi ş • h ü creler S v bir ortamda s ra halinde uyar c ş ktan • (Argon lazer) 488nm ’ de ge ç irilirler ? Uyar c ş ğ ? H ü creler k rarlar veya ? Florokromla i ş aretlenmi ş m Ab ’ lerin ba ğland ğ h ü cre taraf ndan emilir ve yay l r ? Bu yay lan ş ğ n ş iddetini ve niteli ğini alg layan dedekt ö rler bilgisayara aktar rlar ? Buna g ö re; ¦ H ü crenin tipi ve say s belirlenir1’ den 10 ’ a kadar renk eklenebilir – ve bu say ı artmaktad ı rKL İ N İ K KULLANIMI • ? L ö kosit fenotiplemesi (EN SIK) ? Konjenital veya kazan lm ş immun yetersizlik tan s (en s k AIDS ) ? HIV pozitifli ğinde prognoz de ğerlendirilmesi ? İ mmun yetersiz hastalarda immuniteyi yada kemoterapi monit ö rizasyonu ? K İ T yap lan hastalarda yeni immun durumun takibi ? T ü m ö r h ü cre fenotiplemesi ? L ö semi ve lenfoma tan ve s n flamas ? B lenfositlerinde klonal tayini ve lenfoma ve l ö semi ay r m nda ? H ü cre i ç i antijenlerin (myeloperoksidaz miktar ) tayini ? Hematopoetik h ü crelerin (CD4) ? Hematopoetik olmayan ? T ü m ö rler ve h ü crelerden ay rt edilmesiDNA analizi • ? An ö ploidi tayini ? H ü cre sikl ü su kineti ğinin belirlenmesi ? Apoptozis N ö trofil fonksiyon analizleri • ? O2 ’ nin olu ş umunun tayini ile; ? Granulomatoz hastal k tayini Di ğer kullan m alanlar • ? Retik ü losit say m ? Transplant hastalar nda Cross-Match ? SitogenetikENFEKS İ YON HASTALIKLARINDA • ? Mikroorganizma- hedef h ü cre ili ş kisi; ? Apoptozisin incelenmesi ? HIV ile enfekte ki ş ilerde ¦ Monun ü kleer h ü crelerinde apoptosis oranlar ? CD8 T ve ? CD19 B h ü crelerinde en s kt r ? Konak h ü creye ait proteinlerdeki de ği ş imler EBV ile enfekte B lenfositlerinde; ? ¦ BCR2 ekpresyonu HIV ile enfekte T lenfositlerinde; ? ¦ CD4 ekpresyonu CMV ile fibroblastlarda; ? ¦ MHC I ekpresyonu? Mikroorganizman n h ü creye ba ğlanmas n n incelenebilmesi ? EBV ’ nin ¦ B lenfositlerine ¦ Epitel h ü crelerine ? CR2 resept ö r ü ne ? Poliovirus ¦ MNH CD14 resept ö rlerinde ? K zam k virusu ¦ Hedef h ü crelerin CD46 resept ö r ü nde ? H ü cre i ç i ve y ü zeyi mikroorganizma antijenlerini inceleme ? VZV ile enfekte h ü cre y ü zeyinde ¦ gp1 ? HIV ile enfekte CD4 T lenfositlerinde ¦ gp 160/120 ? İ nfluenzae ile enfekte h ü crelerde ¦ HA antijenileri? Klinik virolojide kullan lmaktad r ? Enfekte ki ş ilerin h ü crelerinden ? Virusle enfekte olanlar s ü ratle belirler ¦ CMV ile enfekte MNH ’ ler kantitatif olarak ¦ HIV seropozitif ki ş ilerde ? MNH ’ lerde kantitatif Ag tayini ? B ö ylelikle; *Antiviral tedavinin izlemi ? Spesifik antikor tayini ? CMV, HSV, HIV gibi viruslara ? H. pylori gibi bakterilere ? T.gondii gibi parazitlere kar ş ? Geli ş en spesifik Ab ’ ler ö l çü lebilir2-LENFOS İ T SAYIMI VE AKT İ VASYON TESTLER İ a ) Lenfosit izolasyonu Dansite- Gradient Santrif ü j Y ö ntemi • ? Kan h ü cre gruplar birbirinden farkl dansite ö zelli ğine sahiptir ? 3 ml ficol-isopak (Dansite 1077 gr/lt) konur ? 3 ml heparinli periferik kan konur ? 1500 devirde, 45 dakika santrif ü j edilir ? Lenfositler orta tabakada yo ğunla ş rlar ? En altta eritrosit ve gran ü lositler ¦ Dansiteleri 1077 ‘den fazla ? En ü stte buff-coat toplan r ¦ Dansiteleri 1077 ’ den d üşü k ¦ Buff- Coat ’ dan ? Trombositler (santrif ü j) ? Monositler petri kab nda tutularak uzakla ş t r l rb) Lenfosit ay r m T lenfosit ay r m • ? Rozet testi ? Koyun eritrositlerine kar ş CD2 resept ö r ü vard r ? Periferik kanda E-Rozet yapan ? %65-70 T lenfosit vard r ? B lenfositi E-Rozet yapmazB lenfosit ay r m • ? Direkt immun fluoresan y ö ntemi ? Fluoresanlanm ş (FITC) anti- Ig Ab ile yap l r ? Toplam lenfositlerin %20-25 ’ i B lenfositleridir Periferik kandaki • ? T ve B lenfosit oran n saptamak ? İ mmun yetmezlik hastal klar n n tan s nda ? Lenfosit l ö semi ve lenfomadaki lenfosit tipinin tayininde ? Otoimmun hastal klar ve kanserli olgularda h ü cresel immun yan t n de ğerlendirilmesinde kullan l r NK sitotoksisite ö l çü m ü • ? Antikora ba ğ ml h ü cresel sitotoksisite ö l çü m ü ? CR 51 ile i ş aretlenmi ş ve y kanm ş hedef h ü crelere ? Anti- hedef h ü cre Ig G ile ? FcR bulunan effekt ö r h ü creler (NK, makrofajlar) eklenir ? Hedef h ü crelerden CR 51 sal n r ? Gamma sayac nda CR 51 ö l çü l ü r ? CR 51 miktar , ¦ NK h ü cre say ve aktivite d ü zeyi ile do ğru orant l d r c) Lenfosit Aktivasyon testleri(LAT) Lenfosit uyar m • ? Otoimmunite ? Kanser patogenezinde ? İ ntrasel ü ler enfeksiyonlarda ? H ü cresel immun yan t n ö l çü m ü nde uygulanmaktad r Genelde T h ü cre bazen B h ü cre yan t de ğerlendirilir • Aktive olan T h ü creleri • ? Morfolojik ve fenotipik de ği ş ikli ğe u ğrarlar ? B ü y ü kl ü ğü de ği ş ir ? Histolojik boyamada kromatik de ği ş iklik ? Dinlenme halinde olmayan ? Ancak; aktive oldu ğunda ortaya ç kan y ü zey proteinleri meydana gelirLAT; • ? Hasta lenfositlerinin ? Ö zg ü l antijenle ? Veya ö zg ü l olmayan antijenlerle ? İ nvitro uyar lmas na dayan r ? İ ki tipi vard r 1)Y ü zey fenotipi (aktivasyon belirte ç leri) de ği ş ikliklerini belirlemek ? Aktivasyon belirte ç leri ? Ya enflamasyon b ö lgesinden direkt h ü crelerden ? Ya da invitro uyar lan lenfositlerden aran r ¦ FLOWS İ TOMETR İ ile belirlenir2) Uyar sonras lenfositin proliferasyon yetene ğini ö l ç mek ? Lenfoblast transformasyon testi (LTT) ? 96 kuyucuklu plaklarda yap l r ? T h ü cre uyaranlar olarak ? Fitohemaglutin (PHA) ? Konkovalin A (ConA)gibi lektinlerle ? S ü perantijenler gibi bakteriyel toksinlerle ? B h ü cre uyaranlar olarak, ? S ü perantijenler ? LPS kullan l r LTT TEST İ NDE; ? Antijen ve lenfositlerin 72 saat k ü lt ü r ü yap l r ? H timidin eklenir ? H timidin ç o ğalan DNA yap s na girer ? Radyoaktif veya fluoresan boya ile ? DNA sentez h z ve miktar ö l çü l ü r ¦ Hasta ve kontrol kar ş la ş t rmalar ile yorumlan r? Kar ş k lenfosit k ü lt ü r ü ? Al c ve verici kan ndan ayr lan lenfositler ? İ nvitro besiyerinde kar ş t r larak ? Lenfosit k ü lt ü r ü yap l r ¦ Antijenik farkl l k varsa ¦ Biri di ğerini aktive eder ¦ Blastik d ö n üşü mle DNA miktar artar ? DNA sentezinin kantitatif ö l çü m ü yap l r ? Bazen verici lenfositleri ¦ X ş nlar ile i ş leme sokulur ¦ Blastik d ö n üşü m olmaz ¦ Al c n n lenfositleri uyar l r ¦ Al c n n verilecek Dokuya kar ş reaksiyon ö l çü l ü r ? Buna tek y ö nl ü kar ş k lenfosit k ü lt ü r ü denir ? Doku transplantasyonunda * HLA- D (LD antijenleri) antijenleri saptan r ? Sitolitik T h ü cre yan t n n de ğerlendirilmesinde ? Lenfositotoksik test ? Test prosed ü r ü ? HLA antijeni saptanacak total lenfositler veya CD 19 B lenfosit ? Hangi HLA ’ ya ait oldu ğu bilinen anti-serum ? Kompleman ? Tripan mavisi veya eozin boyas ¦ Antijen + antikor birle ş ir ¦ Kompleman ba ğlan r ¦ Lenfosit zar zedelenir ¦ Boya lenfosit i ç ine girer ¦ Mikroskopta %50 ’ den fazla boyanan lenfosit miktar ? Denenen lenfositleri, bilinen anti- HLA tipine ait oldu ğunu g ö sterir ? Doku transplantasyonunda * HLA A,B,C antijenlerin g ö stermede kullan l rSitokin sentezini belirleme testleri • ? Aktive T h ü creler de ği ş ik sitokinler ü retirler ? Enflamasyon b ö lgesinden elde edilen T lenfositler ? İ nvitro k ü lt ü r ü yap l r ? Total sitokin sentezini verir ? ELISPOT (Enzimle i ş aretli immunspot) ? Belirli T h ü cre grubunun ü retti ği sitokini y ü zde olarak belirler ? Flowsitometrik y ö ntemle ? T ü m farkl sitokin sentezleri ö l çü lebilir3- MONOS İ T/MAKROFAJ TESTLER İ M/M H ü creleri Do ğal ba ğ ş kl kta rol al rlar • ? Ve ö zg ü l ba ğ ş kl ğ sitokinlerle koordine ederler Spesifik patojenleri yok eden efekt ö r h ü crelerdir • Apoptosizde apoptotik h ü creleri temizlerler • ? Bu h ü creler doku ö rnekleri yada h ü cre s ü spansiyonlar ndan MAbs ile saptan rlar ? Monositin en iyi belirlenmesi; ? FLOWS İ TOMETR İ DE ? Anti, CD14 mAbs ile olur ? Ayr ca CD11b, CD11c, CD16, CD32, CD64 gibi ta ş d klar resept ö rlerle tan mlanmalar yap l r ? Histokimyasal boyama olarak ? Non spesifik esteraz Boyamas ? Monositer l ö semi tan s nda kullan l rMAKROFAJ G ÖÇÜ N Ü Ö NLEN İ M TEST İ Duyarl lenfosit ile antijen temas sonucu • ? Salg lanan MIF (Makrofaj g öçü n ü ö nleyen fakt ö r) ? Saptama testidir ? Kapiller t ü pte ? Lenfosit ? Ö zg ü n antijen varsa MIF pozitiftir ? MIF TEST İ N İ N POZ İ T İ FL İ Ğİ ¦ O antijene kar ş h ü cresel immun yan t g ö sterir4-N Ö TROF İ L FONKS İ YON TESTLER İ Polimorf n ü veli n ö trofiller (PMN) • ? Do ğal immunitenin efekt ö r (fagositik) h ü creleridirler ? Enflamasyon b ö lgesine ilk gelen h ü crelerdir ? PMN yetersizli ği ? Ya PMN say sal azl ğ ? Yada PMN fonksiyon bozuklu ğu ş eklinde olabilir ? Bakteriyel enfeksiyonlara yatk nl k sa ğlar ? Yetersizlik ö l çü m testleri; N ö trofil say sal de ğerlendirmesi testleri ? N ö trofil adhezyon de ğerlendirme testleri ? Kemotaksi de ğerlendirme testleri ? Opsonizasyon de ğerlendirme testleri ? Fagositoz yapmay saptama testleri ? Oksidatif patlama ve degran ü lasyon de ğerlendirmesi ? Bakteriyel ö ld ü rmeyi de ğerlendirme testleri ? olarak s n fland r l ra)N ö trofil say s N ö tropeni • ? 500/ml kanda olmas ? Kemik ili ği, malignite, otoimmunite ve kemoterapiye ba ğl geli ş ir ? Mikroskobik boyama y ö ntemleri ? Geli ş mi ş hematoloji ve immuno hemotoloji cihazlar yla saptan r ? FLOWS İ TOMETR İb) Kemotaksi(KT) testleri N ö trofillerin • ? Enflamasyon b ö lgesine hareketine (migrasyonu) KT denir ? Bakteri ü r ü nleri (endotoksin, h ü cre duvar yap lar , bakteri enzimleri) ? Konak fakt ö rleri (C3a ve C5a, LTB4) rol oynar ? Bu kemotaktik molek ü llere yan ts zl k; ? Defektif migrasyon (g öç ) yan t ile sonu ç lan r ? Defektif g öçü saptamada ? BOYDEN odac k testi kullan l r ? Filtre ü zerinde; ¦ Kemotaktik madde ¦ N ö trofillerle yap l r ? Petride agaroz jelde; ¦ Kemotaktik maddeler ¦ N ö trofillerle yap l r ? Kemotaksi testleri ? İ dyopatik immun yetersizlik hastal klar n n tan s nda kullan l rc) N ö trofil adhezyonu N Ö TROF İ LLER İ N Endotele adhezyonu ve enflamasyon b ö lgesine g öçü • ? L-selectin ve İ ntegrinle sa ğlan r ? Bu iki adezindeki yetersizli ğe ? L ö kosit adhezyonu yetersizli ği (LAY) denir ? Bu durumda; ¦ N ö trofil enflamasyon b ö lgesine ula ş amaz ¦ Bakteriyel enfeksiyon yay l r ¦ Abse olu ş maz LAY hastalar nda • ? CD11a/CD 18a LFA-1 (lenfosit fonksiyon antijen-1) l ö kosit integrini yoktur ? Mabs ’ lerle FLOWS İ TOMETR İ ile belirlenird) Opsonizasyon testleri OPSON İ N Mikroorganizmalar n fagositlere ba ğlanmas n • sa ğlayarak fagositozu kolayla ş t ran molek ü llere denir ? IgG1,3 ve IgM, C3b ve iC3b ’ dir ? Opsoninler i ç in ? N ö trofillerde ? Fc R III (IgG ve IgM) ? CR1 ve CR3 (C3b ve iC3b) ? Makrofajlarda ? Fc R I,II,III (IgG ve IgM) resept ö rleri bulunur