Genetik Mühendisliğine giriş Hücre organelleri ve mebran yapıları HÜCRE ORGANELLER İ VE MEMBRAN YAPILARI Doç.Dr. Remisa GEL İŞGENPLAZMA MEMBRAN YAPISI Hücre Membranlarının Özellikleri Hücre içini dı ş ortamdan ve hücre içi organelleri sitoplazmadan membranlar ayırmaktadır. Plazma membranı , hücreye yapısal ve mekanik bütünlük sa ğlayan seçici geçirgen bir yapıdır. Membranlar hücre içinde kompartımanlar olu şturur. İntrasellüler membranlar , mitokondriler , endoplazmik retikulum , golgi aygıtı ,lizozomlar , salgı vesikülleri ve nukleus gibi birbirinden yapısal olarak ayırt edilebilen birçok yapı ( organel ) oluşturur. Membranlar visköz ancak esnek yapılardır.Lipidler, proteinler ve az miktarda glikoprotein ve glikolipid yapısında karbohidratlardan olu şur. Membranlar bir iç ve bir dı ş yüzeye sahip asimetrik çift tabaka şeklinde yapılardır. Bu tabaka şeklindeki yapılar termodinamik olarak kararlı ve metabolik olarak aktif olup , nonkovalan bir yolla bir araya gelmişlerdir (nonkovalan olu şum) . Membranlarınya p ısı , organizmalar arası, hücrelerarası ve organeller arası farklılık gösterir. Farklı fonksiyon : farklı yapı Yapıda değişim : fonksiyonda de ğişimHücre Organellerinin Fonksiyonları Nukleus DNA sentezi ve onarımı RNA sentezi Nukleolus RNA’nın i şlenmesi ve ribozom sentezi Endoplazmik Retikulum Membran sentezi Protein ve lipid sentezi (organeller ve salgılanacak moleküller) Lipid ve steroid sentezi (hidroksilasyon ve desatürasyon) DetoksifikasyonGolgi Aygıtı Proteinlerin işlenmeleri ve etiketlenmeleri (membranlar,organeller ve salgılanacak moleküller) Proteinlerin salgılanmaları Endomembranöz kompartman Mitokondri ATP oluşumu Hücresel solunum Karbohidratların ve lipidlerin oksidasyonu (TCA siklusu, ya ğ asidi ß oksidasyonu,amino asit oksidasyonu,oksidatif fosforilasyon) Üre ve hem senteziLizozom Hücresel sindirim,protein,karbohidrat ve nükleik asitlerin sindirimi Peroksizom Ya ğ asidi oksidasyonu O2 ile oksidatif reaksiyonlar H2O2 kullanımı Mikrotübuluslar,ara filamentler ve mikrofilamentler Hücre iskeleti Hücre morfolojisi Hücre hareketi Hücre içi hareket (transport) Sitozol Karbohidrat,lipid,amino asit ve nükleotidlerin metabolizmaları gerçekleşir. Protein senteziPlazma Membranının Fonksiyonları Bariyer Selektif Permeabilite Endositoz , eksositoz , gap junction Reseptörler ve sinyal iletimi Tanıma ve hücreler arası etkile şim Hücrenin şekil ve hareketi(örn.amiboid hareket)Plazma membranı ,akı şkan mozaik model Lipidler ve proteinler membranda, Singer ve Nicolson ( 1972 ) tarafından akışkan mozaik modeli olarak tanımlanan bir düzende yerle şmektedir. Bu modele göre , plazma membranınınte mel yapısını fosfolipid çift tabakası olu şturmakta , proteinler bu yapıya gömülmü ş veya lipid çift tabakanın iç veya dış yüzeyine tutunmu ş halde bulunmaktadır. Hücre membranınınbi le şimleri Membran Protein Lipid Karbohidrat Myelin 20 75 5 Eritrosit 49 43 8 Karaci ğer ( p.m.) 54 39 7 Dış mitokondri 50 46 4 İç mitokondri 75 23 2 Membranlardaki protein / lipid oranları birbirinde farklılık gösterir.Membran Lipidleri 3 temel lipid komponenti bulunmaktadır. Fosfolipidler Gliserofosfolipidler ( Fosfoaçilgliseroller , Fosfogliseridler ) Sfingofosfolipidler ( Sfingomiyelin ) Glikosfingolipidler Serebrozidler Gangliozidler Kolesterol (serbest kolesterol) Plazma membranında yüksek oranda Akı şkanlık Lipoid matriksle fiziksel etkile şim ProteolipidlerAmfipatik lipidler Membran yapısında bulunan lipidler amfipatik özelliktedir Polar , hidrofilik ve nonpolar hidrofobik gruplar içerirler. Polar , hidrofilik gruplar baş kısmını , hidrofobik gruplar ise kuyruk kısmını oluştururlar.Membran lipidlerinin hidrofobik ve hidrofilik grupları : Hidrofilik grupları : Fosfolipidlerin polar ba şları ( fosforil – alkol ) Sfingomiyelinlerin , fosforil kolin grubu Kolesterolün 3. karbonundaki –OH grubu Glikolipidlerin şekerleri Hidrofobik ( lipofilik ) grupları : Fosfogliseridlerde ya ğ asidlerinin hidrokarbon zincirleri Kolesterolün steran halkası Sfingomiyelinlerde sfingozin ve ya ğ açil zinciri Lipid tabakaları kovalent olmayan etkileşimler ile bir arada tutulmaktadır.Membranda kolesterolün yerle şimi Kolesterol lipid çift tabakada fosfolipid molekülleri arasına yerleşmi ştir.Yapıdaki tek polar grup olan hidroksil grubu sulu ortama do ğru yönelmi ş ve fosfolipidlerin yüklü ba ş grupları ile etkile şimdedir.Polar olmayan steroid çekirde ği ve hidrokarbon zinciri ise fosfolipidlerin hidrokarbon kuyrukları arasında bulunur.Lipoid matriks ile fiziksel etkile şime girer. Plazma membranındaki kolesterolün tamamı serbest kolesteroldür. Kolesterol lipid çift tabakaya kovalent ba ğlarla tutunmadı ğı için , plazma membranından içeriye ve dı şarıya serbestçe hareket edebilir.bu özelli ği nedeniyle kolesterol plazma lipoproteinlerine ya da lipoproteinlerden membrana aktarılabilmektedir. Kolesterol membran akı şkanlı ğını düzenler ; artırabilir ya da azaltabilir.Membran Proteinleri Major fonksiyonel moleküller Enzim D- ß-hidroksibütirat dehidrogenaz / fosfatidil kolin Na+ K+ATPaz / kolesterol Kanal Yapısal komponent Antijen Reseptör Asetil kolin reseptörleri / kolesterol Plazma membranı > 100 çeşit Sarkoplazmik retikulum membran < 12 çe şit İntegral proteinler Lipid tabakalara gömülü/transmembran ( alfa-heliks yapı ) yerle şim gösterirler. Fosfolipidlerle sıkı etkile şimdedirler. Deterjanlarla ( SDS , deoksikolat , Triton X 100 ) veya organik çözücülerle izole edilirler. Eritrosit membranı integral proteinleri Örneğin; anyon kanal proteini glikoforin ( integral glikoprotein yapılı protein ) Hücrelerarası etkile şimlerde rol alan integral proteinler Örneğin ; integrinler , kadherinler , selektinler , immunoglobulin benzeri moleküllerPeriferal proteinler Lipid çift tabakasının hücre içi ve dışı temasta olan yüzeylerine ba ğlıdır. İntegral proteinlere zayıf ba ğlıdır Elektrostatik ve hidrojen ba ğları ile Fosfolipidlere elektrostatik ba ğlıdır. Hidrofobik etkileşim yoktur. Yüksek konsantrasyonda tuz,asid,alkali,üre çözeltileri ile izole edilir. Örneğin anyon kanal proteini ( band 3 ) , ankyrinEnzimler membranları işaretler Plazma membranı ; 5’-Nukleotidaz,adenil siklaz,Na+K+ATPaz Endoplazmik retikulum ; Glukoz 6-fosfataz Golgi ; cis: GlcNAc transferaz I medyal ; Golgi mannozidaz II trans:Galaktozil transferaz TGN:Sialil transferazMembran karbohidratları Glikoprotein veya glikolipid yapısında bulunur. Glukoz,galaktoz,mannoz,fukoz,N-asetilgalaktozamin,sialikasit en sık bulunan karbohidrat birimleridir. Sialik asit , oligosakkarid zincirinin en ucunda bulunur , membran yüzeyine negatif yük kazandırır ve negatif yük hücreler arası nonspesifik agregasyonu önler. Karbohidratlar daima membranınd ı ş ortama bakan yüzeyine yerleşirler. Asimetrik yerle şim Hücre yüzeyine antijenik özellik kazandırırlar. Hücrelerin birbirini tanımaları ve adhezyonda rol alırlar. Proteinin katlanması , hücre yüzeyine transportu , reseptör fonksiyonlarıMembran bile şenlerinin hareketleri Rotasyonel difüzyon : Lipid çift tabakada fosfolipid molekülünün ya ğ asidi hidrokarbon zincirlerinin C-C ba ğları etrafında dönmesi Transvers mobilite ( transvers difüzyon,flip-flop ) : Lipid çift tabakada molekül bir tabakadan di ğerine geçer.Flip flop çok nadir ve yava ştır. Lateral mobilite ( lateral difüzyon ) : Aynı tabaka içinde hızla yana do ğru hareket Bu hareketlerin gerçekleşebilmesi için membranın akı şkan olması gerekir. Akışkanlık Lipid bile şimine ve temparatüre ba ğlıdır. Lipid çift tabaka içindeki hidrokarbon zincirlerinin hareket derecesi membran akı şkanlığı olarak adlandırılır. Membran lipidlerinin bile şimi ve temparatür membranınak ı şkanlığını etkiler.Lipid bile şimi Ya ğ asidi hidrokarbon zinciri karbon sayısı arttıkça akışkanlık azalır , doymamı şlık derecesi arttıkça akışkanlık artar , cis konfigürasyonu akışkanlığı artırır. Kısa zincirli ve doymamış ya ğ asidleri membranı daha akıcı hale getirirken , uzun zincirli ve doymu ş ya ğ asidleri membran akı şkanlı ğını azaltır. Kolesterol:modülatör doymamış ya ğ asidleri arasında : akışkanlı ğı azaltır doymu ş ya ğ asidleri arasında : akışkanlığı arttırır.Temperatür Temparatür arttıkça membran akı şkanlı ğı artarken , düşük temparatürlerde akı şkanlık azalır. Jel-kristallin likid kristallin : transisyon temparatürü ( Tm ) Vücut ısısında ; likid zeminde jelöz bölgeler Yüksek kolesterol , yüksek sfingomiyelin , yüksek doymu ş ya ğ asidi : jel Aynı membranda özellikleri farklı olan bölgeler Permeabilite , transport ve reseptör fonksiyonları için akı şkanlık gerekir. Akı şkanlık arttıkça permeabilite artar. Gap junction ve tight junctionlar akı şkanlı ğı azaltır.Membran asimetrisi İç- dı ş ( transvers ) asimetri Fosfolipidler : Kolin içeren fosfolipidler ( Fosfatidilkolin , sfingomiyelin ) membranınd ı ş tabakasında , Aminofosfolipidler ( fosfatidiletanolamin , fosfatidilserin ) membranın iç tabakasında yer alır. Lateral mobiliteleri hızlı , asimetrik yerle şimleri nedeni ile transvers mobiliteleri ( flip flop ) yava ş Proteinler : Membranların iç veya dı ş kısmında yer alan spesifik enzimler Karbohidratlar : Membranınd ı ş ortama bakan tarafına yerle şir. Fosfolipid asimetrisini sa ğlayan taşıyıcılar : Flippaz,Floppaz,SkramblazBölgesel asimetri Gap junction ve tight junction Sinapslar Mukoza hücrelerinde villuslar Fonksiyonel asimetri Na+ K+ -ATPaz – plazma membranındaLipozomlar - Sentetik membran sistemleridir. - Lipid bile şimi ve membran özellikleri arasındaki ilişkilerin ara ştırılması - Protein fonksiyonu için gerekli protein veya lipidlerin ara ştırılması - Çevresel ko şulların membran fonksiyonları üzerine etkilerinin ara ştırılması - Antibiyotik , antineoplastik , antimalariyal , antiviral, antifungal , antiinflamatuar ilaçlar , enzimler ve genlerin paketlenmeleri - Antikorlu lipozomlar ile dokuların hedeflenmeleri Membran Transport Sistemleri Ta şınacak bile şiğin özelliklerine göre sınıflandırma Küçük moleküllerin geçi şi Basit difüzyon Kolayla ştırılmış difüzyon Aktif transport Büyük moleküllerin geçi şi Endositoz EksositozTa şıyıcı protein varlı ğına göre sınıflandırma 1 . Aracısız transport Basit difüzyon 2 . Aracılı transport Kolaylaştırılmı ş difüzyon : transport proteinler , kanallar : voltaj against , cAMP ba ğımlı Aktif transport Primer aktif transport : pompalar Sekonder aktif transport : pompalar ve transport proteinler Grup translokasyonuBasit difüzyon Konsantrasyon gradyanı yönünde Kolayla ştırılmış difüzyon Elektrokimyasal gradyan yönünde Aktif transport Elektrokimyasal gradyana kar şıTransport : uniport / kotransport Transport sistemleri hareket eden moleküllerin sayısı ve hareket yönüne göre tanımlanabilir. Uniport sistemi , bir tip molekülü çift yönde hareket ettirir. Kotransport sistemlerinde , bir solütün membran boyunca ta şınması , bir di ğer solütün eş zamanlı veya ardışık ta şınmasına ba ğımlıdır ; Simport sistemi : Solütleri aynı yönde hareket ettirir. Antiport sistemi : İki molekülü zıt yönde hareket ettirir.Yarı geçirgen ( semipermeable ) membrandan basit difüzyon O 2 , N 2 , CH 4 , NO gibi nonpolar , küçük ve yüksüz gazlar membranlardan konsantrasyon gradyanı yönünde kolayca difüze olurlar. Üre , etanol , küçük organik asidler : polar ama yüksüz Lipofilik bile şikler membranlardan lipide çözünme dereceleri , şekil ve boyutlarına ba ğlı olarak difüze olabilirler. Su : polar ama yüksüz ve 55 M : osmos Hızlı su geçi şi akuaporinler ( hidrofilik transmembran kanallar )İyonlar membranlardaki porlardan geçebilir. Katyonlar – yükle , anyonlar + yükle çevrelenmi ş porlardan geçebilir. Membranı yüksüz moleküller daha kolay geçer.Tek yük ta şıyanlar , iki yük taşıyanlardan daha kolay geçer. Monovalent > divalent > trivalent pH elektrolitlerin iyonizasyon derecelerini etkiler. İyonların hidratasyon küreleri Li , Na , K iyonlarının difüzyon hızları : K + > Na + > Li + Şekerler ve anorganik iyonlar gibi polar , hidrofilik bileşikler ise çok yavaş difüze olur. Plazma membranının geçirgenli ği , permeabilite kofisienti Basit difüzyon ile transport hızı , solüt konsantrasyonu ile do ğru orantılıdır.Kolaylaştırılmış difüzyon Doygunluk kineti ği ( Vmax , Kt ) gösterir. Özgünlük Yarışmalı inhibisyona u ğrar. Konsantrasyon gradyanı yönünde hareket , iki yönlü Enerji harcamı yok Kolayla ştırılmı ş difüzyona örnekler: Glukoz ta şıyıcı proteinler Doku Fonksiyonu GLUT1 beyin,böbrek,plasenta,eritrosit,kas,kalp glukozun alınımı GLUT2 karaci ğer,pankreas ß hücreleri glukozun hızlı ince barsak,böbrek alınımı ve serbestle şmesi GLUT3 beyin,böbrek,plasenta glukozun alınımı GLUT4 kalp ve iskelet kası,ya ğ dokusu insülin ile stimüle edilen glukoz alınımı GLUT5 ince barsak glukozun emilimi SGLT1 ince barsak ve böbrek (sodyum ba ğımlı glukoz transport protein : sekonder aktif transport ) ince barsak lümeninden glukozun aktif alınımı böbrek proksimal tubulusundan glukozun geri emilimiGluT1: Eritrositte glukoz transportu , GluT 1 aracılı kolayla ştırılmış difüzyon ile gerçekle ştirilir. Uniport sistem ile ta şınır. Basit difüzyondan 50.000 kat daha hızlı D-glukoz için afinitesi yüksek olup , di ğer şekerler için afinitesi çok daha dü şüktür. D- glukoz Kt : 1.5mM , glisemi 4-5 mM L - glukoz Kt > 3000 mM D - mannoz Kt : 20 mM D- galaktoz Kt : 30 mM- İyon kanalları Transmembran oligomerik proteinler Ço ğunlukla bir iyon için selektif Difüzyon hızına yakın hız:10 6 -10 7 /s, doygunluk yok (hızları yüksek konantrasyonuda maksimuma ula şmaz) Voltaj (Na+ iyon kanalı) ve ligand (asetil kolin reseptörleri) kapılı Yüksek derecede korunmu ş yapı Hücrelerin ço ğunda Na + , K + , Ca 2+ , Cl - iyon kanalları Kodlayan genlerde mutasyon Hastalık Aktivitelerini bazı ilaçlar etkiler. - Anyon kanal proteini Eritrositlerde anyon kanal proteini ( Band 3 ) , Cl- ve HCO3- ‘ ın kolayla ştırılmı ş difüzyon , antiport sistem ile ta şınmasını sa ğlar. Aktif transport Doygunluk kineti ği gösterir. Özgünlük gösterir. İnhibisyona u ğrar. Konsantrasyon gradyanına kar şı Enerji harcamı var.Aktif transport tipleri: Primer aktif transport (Na + K + ATPaz : Na + K + transportu) Sekonder aktif transport Na+/glukoz simportu (SGLT,Na + ba ğımlıglukoz emilimi) Na+/aminoasit simportu Ca +2 /Na + antiportuPrimer aktif transport mekanizmaları ATP az’ lar -F-ATPaz : H+ ATPaz Mitokondri iç membranı,FoFı ATPaz,ATP sentezi. H+ elektrokimyasal gradyanı olu şturur ve kullanır. Enerji kenetleyen faktörler -V-ATPaz : H+ ATPaz Lizozom ,endozomlar,golgi ve sekretuvar vesiküllerin asidlendirilmesinden sorumlu proton pompalarıdır. Plazma membranı:kemi ğin yeniden şekillendirilmesi,idrarın asitlendirilmesi Vakuolar-P-ATPaz : Siklik fosforilasyon/defosforilasyon,vanadat inhibisyonu Na+ - K+ ATPaz : Hücrelerin plazma membranlarında , böbrek ve kalp H+ - K+ ATPaz : mide,periteral hücre Ca+2 ATPaz : sarkoplazmik retikulum ve ER Ca+2 ATPaz : plazma membranı,sarkoplazma Cu+2 ATPaz : plazma membranı ve sitoplazmik vesiküller,barsaktan absorbsiyon ve karaci ğerden atılım -ABC transport proteinlerNa + K + ATPaz pompası Na +K +ATPaz tarafından hidroliz edilen her bir ATP ba şına üç Na + iyonu hücre içinden dı ş ortama , iki K + iyonu hücre dışından hücre içine transport edilir. Na + K + ATPaz’ ın inhibisyonu Kardiyak glikozidler:steroid türevi digoksin,ouabain Kronik kalp yetmezli ği tedavisinde kullanılır. Na+ - K+ ATPaz intrasellüler Na+ Na+ - Ca +2 ATPaz antiportu Sitoplazmik Ca +2 Kalp kası kuvvetle kasılır.Ca +2 ATPaz Sitozolde [Ca +2 ] ~100nM:10-7 M Pi , PPi ~mM Ca3PO4 ‘ın çökme tehlikesi!Letal! Plazma membranında Ca +2 pompası ER ve sarkoplazmik retikulumda Ca +2 pompaları (SERCA) 2 Ca +2 /ATP (her ATP hidrolizi ile 2 Ca +2 hücre dışına pompalanır.) Kalsekestrin (kalsiyum ba ğlayıcı protein)Antibiyotikler ve permeabilite Peptid antibiyotikler Mobil iyon ta şıyıcısı : valinomisin Transmembran kanal : gramisidin Polien antibiyotikler(amfoterisin B,nistatin) Valiomisin:K+ iyonoforu ATP sentezinde kenetlenmeyi bozar. ABC Transport Proteinler ABC:ATP binding cassette ATP bağlayıcı bölgeleri çok iyi korunmu ş proteinler:>30;8 aile Substrat spesifiteleri geni ş İyonlar,ağır metaller, şekerler,ilaçlar,amino asitler,peptidler ve proteinlerin transportunda rol oynarlar. Kanal,transport protein veya reseptör fonksiyonlu olabilirler. ATP’ye ba ğımlıdırlar.ABC Transport Proteinler P-glikoproteinler : plazma membranı Çok çe şitli hidrofobik ilaç ve do ğal lipid analoglarının (fosfatidil kolin) ksenobiyotiklerin hücre dışına transportu Multidrug resistance associated proteins (MRPs) : a şırı sentez tümör hücrelerinin ilaçlara kar şı direncini sa ğlar. Kolesterolün hücre dışına transportu,safra asitlerinin karaci ğer kanaliküler membranından transportuSulfonilüre reseptörü : ATP’e duyarlı K+ kanalı ATP/sulfonilüre ba ğlanması kanalı kapatır…depolarizasyon, Ca +2 ve insülin salgılanır. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ABC transport protein ailesinin bir üyesi Cl - için spesifik bir iyon kanalı : Hava yolları ve mide-barsak sistemi eksokrin bezlerinde epitel hücre membranından tuz ve sıvı geçişini sa ğlar. 5 alt birim : 2 transmembran , 2 ATP ba ğlayıcı , 1 düzenleyici ( cAMP ba ğımlı ) ATP bağlayıcı alt birimde Phe 508 delesyonu kanal disfonksiyonu kistik fibrozGrup Translokasyonu:Gama glutamil siklusu Beyin , böbrek, barsak epitel hücreleri Gama glutamil transpeptidaz (GGT) ve GSH Amino asidlerin sekonder aktif transportlarına göre çok enerji 3 ATP / amino asit Hızlı ve yüksek kapasiteli Prolin dışında di ğer amino asidlerEndositoz Endositik vesikül olu şumu Enerji ( ATP ) Fagositoz : makrofaj ve granülositler virus , bakteri , hücre... Pinositoz : sıvı faz pinositoz : seçici de ğil absortif pinositoz : reseptör aracılı (klatrin kaplı çukur) Eksositoz Genellikle hormonal uyarı sonucunda hücre içinde [Ca 2+ ] artı şı ile tetiklenir. Periferik proteinler Ekstrasellüler matriks komponentleri Hormonlar , nörotransmitterler Hücreler arası haberle şme Gap junction Nuklear porlarReseptörler Sinyal iletimi Transport : reseptör aracılı endositoz Antikor oluşumu : antijenik uyarı ile B-lenfositlerinin plazma hücrelerine dönü şümleri Reseptörler Hücre yüzeyi reseptörleri Hücre içi reseptörlerHücre yüzeyi reseptörleri 7 transmembran (alfa –heliks),G proteini kenetli reseptörler İyon kanal reseptörü(ligand kapılı) (asetil kolin reseptörü) Tirozin kinaz aktiviteli reseptör (intrinsik) (insülin) Tirozin kinaz aktiviteli protein ile ili şkili reseptör (GH) Guanilat siklaz aktiviteli reseptör (intrinsik) (ANP) Serin-treonin kinaz aktiviteli reseptör (intrinsik)(TGF-B) Tirozin fosfataz aktiviteli reseptör (intrinsik) (CD45) Ölüm clomeni taşıyan reseptör (TNF ?)Membran Akı şkanlı ğı İle İlgili Hastalıklar Ağır karaci ğer hastalı ğı ( alkolik siroz ) : plazma kolestoerol eritrosit membranında kolesterol akı şkanlık eritrosit yüzeyi dikenli bir görünüm alır. eritrositler dola şımdan erken uzakla ştırılır. spur cell anemia Alkol : Sinir hücrelerinde membran akı şkanlı ğını ( reseptörler , iyon kanalları ) etkiler. Abetalipoproteinemi : Hücre membranlarında ssfingomiyelin Fosfatidil kolin akı şkanlık Anestetikler : lipidlerde çözünür , akı şkanlı ğı artırırlar.