1 - Tıbbi Mikrobiyoloji Mikobakteriler = Mycobacterium Tuberculosis M İ KOBAKTER İ LER: MYCOBACTER İ UM TUBERCULOS İ S Prof.Dr. A. Nedret KOÇ Erciyes Üniversitesi T ı p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal ı KAYSER İMycobacterium cinsi Mycobacteriaceae ailesinin tek cinsi ? Dünyaca yayg ı n olan tuberküloz etkenleri ? İ nsanl ı k tarihinde eski bir geçmi ş e sahip olan ? lepra etkenleriniTarihçe Villemin 1865 dolaylar ı nda tüberküloz ? infeksiyonu belirlemesine 1882 de Robert Koch tüberküloz basilini ? ve hastal ı k ile ili ş kisini ilk defa kurmu ş 1886 y ı l ı nda M. tuberculosis ismi ? verilmi ş Robert Koch tüberküloz alerjisi, ? immuniteyi ve tüberkülini tarif Mycobacterium bovis: S ığı r ? tüberküloz basili ayr ı bir tür olarak 1896 da Th. Smith taraf ı ndan ortaya at ı lm ı ş Mycobacterium microti:Tarla ? faresinden fare tüberküloz basili 1937 y ı l ı nda izole edilmi ş Mycobacterium africanum ?S ı n ı fland ı rma Mycobacterium cinsi ? Mycobacteriaceae ailesinin tek cinsidir. DNA lar ı n ı n yüksek G+C miktarlar ı ? (%62-70), di ğ er mikolik asit üreten Nocardia (%60-69), Rhodococcus (%59-69) ve Crynebacterium spp. (%51-59) ile benzerdir. Mycobacterium cinsi Mikobakteriler içinde en s ı k görülmesinden ? dolay ı hemen akla Mycobacterium tuberculosis gelirMycobacterium tuberculosis kompleksi Mycobacterium tuberculosis ? Mycobacterium bovis ? Mycobacterium microti ? Mycobacterium africanum ? Mycobacterium canettii ? Mycobacterium pinnipedia ? M. Caprae ? M. bovis BCG ?Mycobacterium tuberculosis compleksi d ı ş ı ndakilere A tipik mikobakteriler ? Nontuberculous mycobacteria (NTM) ? Tüberküloz d ı ş ı mikobakteriler ? Familyan ı n en önemli karakteri Zor boyanan, ? Boyalar ı n uzun süre tutulmas ı veya ı s ı ile ? uygulanmas ı halinde alabilen Bir defa boyand ı ktan sonra boyalar ı asit ve alkol ? kar ı ş ı m ı nda kolay b ı rakmayan, Asitlere dirençli çomak ş eklinde bakterileri ? içermesidirMycobacterium cinsindeki Yava ş üreyenler ideal kültür ortam ı nda kat ı ? besiyerinde gözle görülebilen koloniyi 7 günde, H ı zl ı ürüyenler 7 günden önce olu ş tururlar. ? Runyon 1959 y ı l ı nda ? Bakterilerin pigment yap ı p yapmamas ı na, ? pigmetin ı ş ı k kar ş ı s ı nda Karanl ı l ı kta olu ş mas ı na ? Üreme h ı zlar ı na göre ve koloni karekterlerine ? bakarak bir s ı n ı fland ı rma yapm ı şFotokromojenler (I ş ı kta pikment olu ş turmas ı ) Mycobacterium kansasii ? Mycobacterium marinum ? Mycobacterium simiae ? Mycobacterium asiaticum ?Skotokromojen grup (Karanl ı kta pikment olu ş turmas ı ) Mycobacterium scrofulaceum ? Mycobacterium gordonae ? Mycobacterium szulgai ? Mycobacterium flavescens ?Non fotokromojen grup (pikment olu ş turmaz) Mycobacterium avium-intracellulare ? (MAC) M. haemophilum ? Mycobacterium xenopi ? M. shimoidei ? Mycobacterium ulcerans ? M. genavense ? Mycobacterium gastri ? M.nonchromogenicum ? Mycobacterium terrae complex ? Mycobacterium malmoense ? Mycobacterium triviale ? Çabuk üreyenler Mycobacterium fortuitum coplex ? (Mycobacterium fortuitum , M. chelonae, M. abscessus) Mycobacterium smegmatis ? Mycobacterium flavescens ? Mycobacterium thermoresistibile ? Mycobacterium neoaurum ?Morfoloji ve boyanma özellikleri M. tuberculosis ince, ? düz, hafif k ı vr ı k, sonu küt olarak biten bir basil Geni ş li ğ i 0.3-0.6 µm ? geni ş likte, 1-4 µm boyunda Zaman zaman gerçek ? dallanma görülür (Ya ş l ı kültürlerde ve lenf nodlar ı ndan smearlerde ve ayr ı ca spesifik kültürlerde) Morfoloji ve boyanma özellikleri Sporsuz, ? Kapsülsüz ? Hareketsiz ? Asit ve alkole dirençli ? Boyanma özellikleri, fiziki bütünlü ğ ü yan ı nda ? hücre duvar ı ndaki mikolik asit ve lipid bariyer sistemine ba ğ l ıBoyanma Ehrlich-Ziehl-Neelsen ? Kinyoun asit-faz ve ? Auromin-rodamin boyama ?Ehrlich-Ziehl-Neelsen Mavi zemin üzerinde ? parlak k ı rm ı z ı boyanan basiller Dokuda ve balgamda ? vakuol ve polifosfat ihtiva etti ğ inden dolay ı boncuk veya tespih tanesi içeriyor gibi irregüller boyan ı r Karbon fuksin hücre ? duvar ı na penetre olmas ı için alttan ı s ı t ı lmas ı gerekir Kinyoun asit-faz boyama Hücre duvar ı na penetrasyonunu art ı rmak için ? çözeltideki fenol miktar ı n ı n art ı r ı ld ığı so ğ uk boyama yöntemi Mikobakterilerin asit faz boyanmas ı Hücrenin fiziksel yap ı s ı ndaki lipid içermesine ? ba ğ l ı Hücre duvar ı nda var olan mikolikasit ile ? boyan ı n kompleksinin takibinde yüzeyel tabakan ı n hidrofobisitesinin art ı ş ı bu olay da rol oynar Karbon fuksin hücre için de d ı ş ar ı ç ı k ı ş ı ? engellenirAuromin-rodamin boyama Mikobakteriler, koyu ? renkli zemin üzerinde parlak sar ı ve 25X objektif ile kolayl ı kla görülür Karbol-fuksin ? yöntemine göre daha duyarl ı d ı rMycobacterial hücre duvar ı İ nce kesit elektron mikroskopisi ile plazma ? mebran ı n ı saran üç tabakadan olu ş an kal ı n duvar içeri ğ ini Kimyasal olarak duvar yeri komplekstir. ? Hem gram pozitif hem de gram negatif ? organizmalara benzemez A ğı rl ığı n ı n %60 ı n ı olu ş turan yüksek oranda ki ? lipidlerdir Mikobakterilerin türüne göre kal ı nl ığı de ğ i ş ir ?Mycobacterial hücre duvar ı Biyolojik olarak çok aktif ve bunlar ı n bir ? ço ğ u organizma için tek olan lipofilik makromoleküler kompleksini içerir Fosfodiester ba ğ lar ile ba ğ lanan ? peptidoglikan ve arabinogalaktan ı n kovalent yap ı s ı ndan olu ş ur Peptidoglikanlar ı di ğ er bakterilerden ? farkl ı d ı r Mycobacterial hücre duvar ı İ nterpeptitler aras ı köprüler sadece ? mikobakterilerde Arabinozlar ı n 10 tanesinden en az biri ? mikolik asite esterifiye olur Mikolik asit tipik uzun zincirli ya ğ asitidir ? En d ı ş tabaka peptidoglikolipid ve fenolik ? glikolipid içeren heterojen bir grup olan mikozidlerden olu ş mu ş tur.Mycobacterial hücre duvar ı Arabinogalaktan ı n terminal dallar ı temel ? immunolojik determinatlar ı olu ş turur Hücre duvar ı n ı n oligomeri, Wax D, ? immunoadjuvant aktiviteden sorumlu peptidler tuberkülin aktivitesi için ? temeldir Glikolipidler;cord faktör (trehalose 6, 6 ’ - ? dimycolate), sulfatidler, ve mikosidler biyolojik olarak aktiftir Hücre duvar ı nı n etkileri Kimyasal ve fiziksel etkenlere direnç ? Virulans, makrofajlardan korunma ? Uzun jenerasyon süresi ? Zor boyanma ve aside dirençli boyanma ? özelli ğ i Adjuvan etki ? Gecikmi ş tip a ş ı r ı duyarl ı l ı k ? Ani a ş ı r ı duyarl ı l ı k ?Kültürel karakterleri Zorunlu aeroptur ? Basit besiyerinde ürüyemez ? Yumurta-patetes (Löwenstein-Jensen), ? serum-base agar veya agar-base media (Middlebrook 7H-10) Yava ş ürer, gözle görülecek üremesi optimal ? üreme ko ş ullar ı nda 37 0 C de 10-20 gün Kültürel karakterleri Koloniler küçük, kuru ? siğ il gibi Hücre yüzeyinin ? hidrofobik özelli ğ inden dolay ı sentetik s ı v ı besiyerinde yüzeyinde ince zar gibi ürerKültürel karakterleri Noniyonik deterjan olan Tween 80 ? (sorbitan monolat ı n polyoxyethylenenin derivesi) hücrelerin agregasyonunu önleyerek onlar ı n difüz olarak üremesini sa ğ lar Kültürlerin çalkalamak havaland ı rmay ı ? art ı rd ığı için büyüme oran ı n ı art ı r ı r Büyüme %5-10 CO 2 ile de artabilir ? CO 2 sa ğ lamak için mumlu kavonoz ? kullan ı lmazKültürel karakterleri Mikobakteriler O 2 ’ li ortam ı sever ? Büyüme için optimal pH 7.0 fakat 6- ile ? 7.6 aras ı nda Optimal üreme ı s ı s ı 37 0 C ’ dir ? Di ğ er mikobakteri türleri için üreme ı s ı s ı ? onlar ı n spesifik do ğ al konaklar ı n ı n vucud ı s ı lar ı ile de ğ i ş ebilirMetabolizmas ı Enerjilerini glikoz ve gliserolden sa ğ larlar ? Gliserollu karbon ve enerji kayna ğı ? olarak tercih ederler. Katalaz ve peroksidaz bütün mikobakterilerde ? vard ı r Uygun kültür ko ş ullar ı n da yar ı lanma ömrü 14- ? 15 saatBesin gereksinimi Üremesi için bütün amino asitler, pürin ? ve pimidin baz ve B-kompleks vitamin ihtiyaç En önemli karbon kayna ğı gliserol ve ? nitrojen kayna ğı olarak asparjini tercih ederOksijen gereksinimi Oksijen mikobakterilerin invitro ve invivo ? üremesi için kriter Oksijen s ı n ı rland ığı ortamlarda basil latent ? kal ı r oksijen oldu ğ u besiyerinde tekrar üremeye ba ş larMycobacterium ’ lar ı n antijenik yap ı s ı Mycobacterium ’ lar ı n birçok immunoreaktif ? yap ı lar ı vard ı r: Old tuberculin ? Purified protein derivative (PPD) ? Purified antijen ? Polisakkaritler (arabinogalaktan ve ? arabinomannans) Phophatidyl inositol mannosides ? (fosfatil inositol mannosid)Old tuberculin Tüberkülün testi (tüberküloz ? infeksiyonunun tan ı mland ığı cilt testi) için orijinal test maddesi İ lk defa Koch 1881 ’ de tan ı mlam ı ş t ı r. 6 ? haftal ı k s ı v ı besiyerinde kültürün kaynat ı larak ve organizmay ı filtrasyonla ay ı rarak elde edilen ı s ı ya dayan ı kl ı bir proteinPurified protein derivative (PPD) Old tuberkülünün pürified preparasyonudur. ? Dünya sa ğ l ı k organizasyonu tüberkülün deri ? testi için bu maddeyi önermektedirler.Purified antijen 65 kDa antijen (heat shock protein) deney ? hayvan ı nda yüksek oranda geçikmi ş tip hipersensitivity reaksiyonlar ı na neden olur Otoimmun hastal ı klar ı nda etyolojilerinde rol ? oynar. Polisakkaritler (arabinogalaktan ve arabinomannan) İ mmunolojik ve serolojik aktiviteye ? sahiptir. Erken cilt reaksiyonlar ı na neden olur. ? Bunlara kar ş ı olu ş mu ş humoral antikorlar ı n ? önemi daha belirlenememi ş tir.Fosfatil inositol mannosid Plazma membranlar ı nda lipidleri ailesindendir ? Hücre mebran ı ve hücre duvar ı aras ı nda ? nonkovalent ba ğ lar sa ğ l ı yarak hücre yap ı s ı nda rolü önemlidir Haptonik olmas ı na ra ğ men, immunolojik form ? ve serolojik aktivitede gösterir Makrofajlar ı tan ı ma ve muhtemelen koruyucu ? immunitenin kar ş ı t ı bir rolü ile önemli lipoteikasit benzeri polimerler oldu ğ u inan ı lmaktad ı r.Di ğ er immunoreaktif kompenentler: Wax D ve muramlyldipeptide ? (peptidoglikolipidler) Trehalose-6,6 ’ -Dimycolate ? (trehaloso dimikulat): Cord faktör ( İ p faktör) Sulfatidler ?Wax D ve muramlyldipeptide (peptidoglikolipidler) Bu maddeler adjuvan özelli ğ inde ? maddelerdir. kombine oldu ğ unda sinerjik immuno ? stimulatör aktivite gösterir Tümörlere kar ş ı etkilidir. ? Trehalose-6,6 ’ -Dimycolate (trehaloso dimikulat): Cord faktör ( İ p faktör) Tüberküloz basillerin iplik ş eklinde ? üreme Adjuvant aktivite sahiptir ? Alternatif kompleman sistemini aktivite ? eder Antitümor özellikleri verir ?Sulfatidler Glikolipidler dir ? Virulent M. tuberculosis ’ lar ı n nötral red ? reaksiyonlar ı ile ili ş kilidir Spesifik immunostimulatör özelli ğ i küçüktür ?Patojinite determinatlar ı M. tuberculosis ekzotoksin ve ? endotoksin üretmezler Tek bir yap ı , antijen, veya mekanizma ? organizman ı n virulans ı n ı aç ı klayamaz Bula ş ı c ı l ı k M. tuberculosis için tek kaynak ? insand ı r ki ş iden ki ş iye geçi ş i solunum yolu ile ? olur Canl ı tüberküloz basili içeren ve havada ? as ı l ı halde bulunan küçük (1-5 mikron) damlac ı klar ı n solunum yolu ile al ı nmas ı ve bunlar ı n alveollere yerle ş meleri ile gerçekle ş ir Di ğ er geçi ş yolar ı : gastrointestinal, ? deri, ? süt, ? cinsel yolla, ? hematojen yolla ? direkt hastal ı ktan lokal ? ven ve lenfatik yolla da bu hastal ığı n ? yay ı ld ığı gösterilmi ş tirTüberküloz basilinin direnci Bir çok kimyasal dezenfektanlara di ğ er sporsuz ? bakterilere göre dirençlidir. Organik asitler ve doymam ı ş ya ğ asitleri, %70-95 ? alkolle 10 dakika dayanamaz. Aseton iyot tentür bakterileri h ı zla öldürür. ? %5 sodyum hipoklorit ve %3-8 formaldehit 10- ? 30 dakikada öldürür. Kurulu ğ a dirençlidir. ?Tüberküloz basilinin direnci Ölülerin vücudunda uzun süre canl ı ? kal ı rlar. Kurumu ş balgamda aylarca kal ı r. ? Toprakta ve sularda 4-5 ay ya ş ayabilir. ? Güne ş ı ş ığı ndan uzak olmak ko ş ulu ile ? sokak tozlar ı nda 10 gün, hastalara ait kitaplarda 3.5 ay canl ı kalabilir. Ba ğı ş ı k mekanizmas ı ile ilgili olaylar Hücresel ba ğı ş ı kl ı k rol oynar. ? Bakterilerin virulans ı , hücresel a ş ı r ı duyarl ı k ve ? hücresel ba ğı ş ı kl ı k olaylar ı n ı n kar ş ı l ı kl ı dengesi ile s ı k ı ya ilgilidir. Bu olay ı aç ı klay ı c ı en önemli olay Koch ? fenomoni dir. Koch fenomoni Sa ğ lam kobaya ? tüberküloz basilinin enjekte edersek: yara olu ş tu ğ u, aç ı ld ığı , lenf bezleri olaya kat ı ld ığı , vucuda yay ı ld ığı , sonunda kobay ı n öldü ğ ü görülür İ kinci deneyi ölü basille ? uygularsak; ikincine benzer reaksiyon olu ş ur İ kinci deneyi ölü basille ? uygularsak; ikincine benzer reaksiyon olu ş urKoch fenomoni Birinci deneyde olay; Hücresel ? ba ğı ş ı kl ı kt ı r İ kinci deneyde olay; Hücresel a ş ı r ı ? duyarl ı l ı kt ı r.Aş ı r ı duyarl ığı n ve direncin saptanmas ı Eski Tüberkülin: İ lk R. Koch haz ı rlami ş t ı r. ? PPD (Purified Protein Derivative): ilk ? Seibert ve Glenn taraf ı ndan haz ı rlanm ı ş t ı r. Pratikte tüberkülün duyarl ığı n ı ? ara ş t ı rr ı lmas ı nda en s ı kl ı kla kullan ı lan PPD ile uygulanan Mantoux testdir. Tüberkülin testi infeksiyonda ortalama 4-6 ? hafta sonra olumlu hale geçer. Alerji meydana gelinceye kadar geçen bu zamana preallerjik dönem denir.İ nsanlarda ki tüberküloz infeksiyonu İ lk veya primer infeksiyon ? Yeniden infeksiyon ( Re-infeksiyon) ?Tüberkülozun klinik önemi Akci ğ er infeksiyonu ? Seroza infeksiyono (plevral, menejit, periton) ? Eklem ve kemik tüberkülozu ? Lenf bezi tüberkülozu ? Deri tüberkülozu ? Böbrek ve genital sistem (epididim, testis, ? ovarium, uterus vb.) tüberkülozuTüberkülozun klinik önemi Ba ğı rsak tüberkülozu ? Göz ve di ğ er organlar tüberkülozu ? Milyer tüberkülozu: Dirençsiz ve duyarl ı ? ki ş ilerde bakterilerin kana geçip yay ı larak tüm organlara yerle ş mesi ile olu ş an a ğı r infeksiyona denir.TANI Klinik tan ı ? Laboratuvar tan ı ?Hastadan al ı nan klinik örnekler: Balgam, bronkoalvoler lavaj, bro ş iyal ? y ı kama, gastrik lavaj s ı v ı s ı , kan, idrar, d ı ş k ı , di ğ er vücut s ı v ı lar ı (BOS, plevra, perikart, peritoneal ), dokular ( lenf nodu, cilt, di ğ er biyopsi örnekleri), abse örne ğ i, aspirat s ı v ı lar ı , deri lezyonlar ı ve yaralard ı r Örneklerin İ ş lenmesi: Normal steril örnekler: ? Dekontaminasyon ve homojenasyon ? i ş lemine gerek yoktur. S ı v ı örnekler >3,000 devir de santrefüj ? edilir ve sediment hem s ı v ı hemde kat ı besiyerine inokule edilir. Kontamine örnekler: Eritme ve dekontaminasyon i ş lemine ? tabi tutulurEritici ve dekontaminasyon i ş leminde kullan ı lan yöntemler: NALC-NaOH yöntem (N-Acetyl-lcystein-NaOH) en ? s ı kl ı kla kullan ı l ı r Sodyum hidroksit yöntem: Hem eritici hemde ? dekontamine edicidir Zefiran-trisodyum fosfat yöntem: Trisodyum ? fosfat eritici, zefiran dekontamine edicidir. Ancak zefiran bakteriostatik oldu ğ u için özellikle BACTEC sistemde kullan ı lmaz Oksalik asit yöntem: Özellikle Pseudomonas ? spp. ile kontamine kültürlerler için tercih edilmelidir. BACTEC sistemde de kullan ı labilir. CPD-sodyum klorit yöntem: CPD kuaternar ? ammonyum birle ş i ğ idir Sülfürük asit: dekontaminasyon için kullan ı l ı r ?Asit faz boyama: Ehrlich-Ziehl- Neelsen ve Kinyoun Asit faz boyama boyama Organizma vakuol ve ? polifosfat ihtiva etti ğ inden dolay ı boncuk veya tespih tanesi içeriyor gibi irregüller boyana ı r. Karbon fuksin hücre ? duvar ı na penetre olmas ı için alttan ı st ı lmas ı veya, Çözeltideki fenol ? miktar ı n ı n art ı r ı ld ığı so ğ uk boyama yöntemi temeline dayan ı rAsit faz boyama Hücrenin fiziksel yap ı s ı ndaki lipid ? içermesine ba ğ l ı d ı r. Hücre duvar ı nda var olan mikolikasit ile ? boyan ı n birle ş mesi takibinde yüzeyel tabakan ı n hidrofobisitesinin art ı ş ı bu olay da rol oynar. Flurokrom boyama: Auromin veya auromin-rhodamin boyama mikobakteriler, koyu ? renkli zemin üzerinde parlak sar ı ve 25X objektif ile kolayl ı kla görülür. Karbol-fuksin ? yöntemine göre daha duyarl ı d ı rKültür yöntemleri İ n vitro ilk ? izolasyonlar ı nda kompleks besiyeri gerekir baz ı mikobakteriler ilk ? izolasyonlar ı ndan sonra basit sentetik besiyerinde üreyebilir Selektif ve nonselektif ? besiyeri vard ı rKat ı besiyeri 1- Yumurtal ı -baz besiyeri ? 2- Agar-bas besiyeridir. ?Yumurtal ı -baz besiyeri Yumurta, patates unu, tuz ve ? gliserol ihtiva eder. Besiyeri ilaç duyarl ı l ı k ? testlerinde kullan ı lmaz. Lowenstein-Jensen (LJ) ? besiyeridir. En s ı k kullan ı l ı r Petragnani besiyeri LJ ’ den ? daha fazla mala ş it yeş ili ihtiva eder.Bu ba ı su ş lar ı n üremesini inhibe edebilir Koloniler Yumurtal ı -baz ? besiyerinden 18-24 gündeAgar-baz besiyerleri Bu besiyerleri transparan olduklar ı için ? mikroskopik koloniler kolayca görülür. Koloniler LJ besiyerinden daha önce (10- ? 12 günde) görülür. En s ı k kullan ı lan Agar-baz besiyerleri ? Middlebrook 7H10, 11,12 dir. Bu besiyerleri antitüberkülotik duyarl ı l ı k ? testi için kullan ı labilir. Kontaminantlar kolayca üremez. Besiyeri pahal ı d ı r ve Saklama süresi ? daha k ı sad ı r. (buzdalob ı nda 1 ay) Besiyeri ı s ı , ı ş ı k maruz kald ığı nda ? formaldehit salarS ı v ı besiyerleri Middlebrook 7H9 ve Dubos Tween ? albumin s ı v ı besiyeri en s ı k kullan ı lan besiyerleridir. Subkültür için stok su ş lar ? Antitüberkülotik duyarl ı l ı k testi ? S ı v ı besiyeri bakteri miktar ı dü ş ük oldu ğ unu ? dü ş ünüldü ğ ü örneklerden izolasyonlarda Tween 80nin küme yapm ı ş mikobakterileri ? da ğı l ı m ı n ı sa ğ larBACTEC AFB sistem Radyometrik sistem olan ? BACTEC AFB sistemi geli ş tirmi ş lerdir. Karbon kayna ğı olarak sadece ? 14 C ile i ş aretli palmitik asit içeren s ı v ı besiyerine Besiyerinde basil üredikçe ? ortama 14 CO2 verilmektedir. BACTEC 460 cihaz ı besiyerinde ? ki 14 CO2 ölçmekte ve bunu Growth index (üreme indeksi) olarak rapor etmektedir. M. tuberculosis 9-14 günde, ? tüberküloz d ı ş ı mikobakteriler 7 günden önce belirlenir. BACTEC AFB sistem BACTEC 13A ş iseleri kan ve kemik ili ğ i ? örnekler için kullan ı l ı r. BACTEC 12B ş iselerine içinde ? Middlebrook 7H9, BSA, kasein hidrolizat, katalaz, 14C i ş aretli palmitik asit, antimikrobik ajanlardan vard ı r. M. tuberculosis kompleks di ğ er ? tüberküloz d ı ş ı mikobakterilerden NAP (P-Nitro-ß-acetylamino- ß - hydroxypropiophenone) testi ile ay ı r ı r. NAP konulan besiyerinde üreme olursa M. tuberculosis kompleks dir Antitüberkülotik duyarl ı l ı k testi için de ? kullan ı labilir Selektif Besiyeri LJ, Middlebrook 7H10,11 besiyerlerine ? kontaminant bakterilerin üremesini önlemek için konulan antimikrobiyal ajanlard ı r (penisilin, nalidiksik asit, sikloheksimit, linkomisin, karbenisilin, polimiksin, trimetoprim, amfoterisin B konulabilen antibiyotiklerdir Bifazik besiyerleri: Septi- Chek sistem biri s ı v ı (Middlebrook 7H9 20ml) di ğ eri 3 kat ı besiyeri ? (LJ, Middlebrook 7H11, çukulata besiyeri) Besiyerine eklenen maddeler: glikoz, gliserin, oleik ? asit, pridoksal HCI, katalaz, albumin, polimiksin, trimetoprim, amfoterisin B, nalidik asit, azlosilin Çukolata bakteriyel kontaminasyonu gösterir. ? Sistemin sensitivitesi BACTEC AFB benzerdir. Üreme peryodu daha uzundur, geleksel sistemlerden ? daha k ı sad ı r. Dü ş ük örnekle çal ı ş ı lan laboratuvarlarda kullan ı labilir ? Antitüberkülotik duyarl ı l ı k testi ve kan kültürleri için ? kullan ı lmaz M. haemophilus için hem içeren besiyeri Middlebrook 7H10 agara hemolize koyu ? eritrositi, hemin, veya X faktör diski veya LJ besiyerine %1 ferrik amonyum sitrat eklenerek haz ı rlan ı r MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) Middlebrook 7H9 s ı v ı besiyeri, OADC( oleik asit, ? albumin, dekstroz, katalaz), Panta (antibiyotik) ve tüpün dibindeki silikona emdirilmi ş halde oksijene duyarl ı bir fluoresans gösterge maddesi içermektedir. Tüpte üreyen mikobakteri oksijeni kullanmas ı , bunun ? sonucunda olu ş an fluoresans ı n ultraviyole lambas ı alt ı nda saptanmas ı d ı r. Antifungal duyarl ı l ı kta yap ı labilir. ? radyoaktif madde ve pahal ı aletlere ihtiyaç ? göstermemesi üstünlü ğ ü Basiller 4-14 ürer. ?MB/BacT Alert kültür sistemi Modifiye edilmi ş Middlebrook 7H9 ? besiyeri içeren kültür ş i ş elerinde otomize edilen sistemde üremenin varl ığı kolorimetrik olarak saptan ı r. Üretim süresi BACTEC sisteme ve MGIT ? ile k ı yaslanabilirLizis-santrifüj (izolator sistem) Özellikle kanda mikobakterile üretimi ? için önemlidir. İ zolator sistem saponin ihtive eder. Bu hücreleri eritir ve mikobakterilerin aç ığ a ç ı kmas ı n ı sa ğ lar. Izolator sistemde al ı nan sediment LJ, 7H11 kat ı veya s ı v ı besiyerine inokule edilir İ nkübasyon Mikobakterilerin bir ço ğ unun ? ürüyebilmesi için 35-37 o C inkübasyon ı s ı s ı gerekir. M. marinum, M. ulcerans, M. ? chelonae veya M. haemophilum 25- 33 o C gibi daha dü ş ük inkübasyon ı s ı s ı nda ürüyebilir Atmosfer Mikobakterilerin üremesini %5-10 ? CO 2 ’ lik ortam art ı r ı r. Ancak mumlu kavonoz mikobakterilerin inkübasyonlar ı için kullan ı lmaz. Çünkü mikobakteriler O 2 azald ığı ortamda üreyemez. Middlebrook ve LJ için CO 2 ortam gerekir. Ancak BACTEC ve Septi-Chek için gerekmez Zaman Mikobakteriyel kültürler negatif olarak ? tan ı mlamadan önce genellikle 6-8 hafta Cilt lezyonun da ş üphenilen M. ulcerans için ? kültür 12 hafta Solit kültürler ilk inkübasyonlar ı n ı n 3.-5. ? günün de erken üreyen mikobakteri türleri belirlemek için her gün incelenir. Daha sonra 4 haftan ı n üzerindeki kültürler hafta iki kez incelenir. Daha ya ş l ı kültürler haftal ı k incelenir M İ KOBAKTER İ LER İ N TANIMLANMASI Üreme h ı z ı , ? optimal ı s ı , ? koloni morfolojisi, ? pigment üretimi, ? niasin testi, ? T2H (thiophene-2-carboxylic ? acid hydrazid) de üremesi, nitrat redüksiyonu, ? semikuantatif katalaz, ? 60oC ’ de katalaz, tween 80 hidroliz, ? tellürit redüksiyonu, ? %5 NaCl ’ a tolerans, ? demir al ı m ı , ? 3 günde arilsülfataz hidrolizi, ? MacConcey agarda ? üreyebilmesi, üreaz üretimi, ? pirazinamidaz testi gibi ? biyokimyasal testler kullan ı l ı rM İ KOBAKTER İ LER İ N TANIMLANMASIİ dentifikasyonda yeni yöntemler: Kromotografik analiz, nükleik asit problar ? Kromotografik analiz: İ nce tabaka ? kromotagrafi, kapiller gaz kromotografi ve HPLC yöntemi ile ya ğ komposizyonunu analizi ile mikobakterler tür düzeyinde identifiye edilebilinir. Direkt örnekten mikobakteriyel ? birle ş enlerinide belirleyerek direkt belirlemedede kulan ı l ı r Tuberkulostearik asit (TSA) Gaz likit kromotografi ve kitle ? spektroskopi kombinasyonu ile klinik örneklerden belirlenebilir ve bu TSA sadece mikobakterilerde ve aktinomiçeslerde bulunmaktad ı r BOS ve balgamda TSA n ı n belirlenmesi ? tüberkülozun belirlenmesinde çabuk ve duyarl ı bir testtir Adenizin deaminaz (ADA) Adenizin inozine dönü ş ümünü katalizleyen ? Monosit, makrofaj ve lenfositlerin farkl ı la ş mas ı nda rol oynayan bir enzimdir. İ nfeksiyoz mononükleoz, brusella, tifo gibi ? infeksiyonlarda, romatoit artirit, dissemine sistemik lupus eritematozis, lenfoma ve lösemi gibi hastal ı klar ı nda düzeyleri artar. Bundan dolay ı spesifik test de ğ ildir ?Lizozim Lizozim aktif makrofaj, monosit ve ? granülositlerden salg ı lanan bir enzimdir. Tüberküloz plörezilerde plevral s ı v ı da ? artm ı ş olarak bulunmaktad ı r. Duyarl ı l ığı %100, özgürlü ğ ü %88 olarak ? bulunmu ş tur . Karsinomatöz olaylarda da yükselebilir ?Kültür do ğ rulamak için DNA proplar Mycobacterium tuberculosis ? kompleks, MAC, M. gordonae, M. kansasii ’ in türe spesifik rRNA çifti ticari olarak bulunmaktad ı r Nükleik asit amplifikasyon ve hibridizasyon yöntemleri Direkt belirlemede proplar kullan ı lmamakta ? Direkt örnekte belirlemelerde nükleik asiti PCR ? ile ço ğ altarak özgül nükleik asit proplar kulan ı larak saptanabilir. PCR eski tüberküloz öyküsü olan ölü basil ? bulunduran hastalarda da pozitiflik verebilir Kültür yap ı lmadan basilin saptanmas ı PCR (Hedef nükleik asitlerin PCR ile ? ço ğ alt ı lmas ı )Klinik örneklerden Mikobakteriyel antikorlar ı n gösterilmesi Mikobakteriyel antjenlere maruz kalanlarda ? IgM, IgG ve IgA türü antikorlar olu ş ur. serolojik yöntemler ile belirlenebilir. Antikorlar hem basille infekte hemde BCG ? a ş ı s ı ve tüberkülin deri testi yap ı lan ki ş ilerde üretildi ğ inden tan ı da spesifitesi dü ş üktür Örnek al ı m ı n ı n zor oldu ğ u durumlarda ? kullan ı labilirMikobakteriyel antijenlerin gösterilmesi PPD, antijen 5 ve antijen 60 yar ı saf, 33kD, ? 38kD, 45kD, TB23, TB68, ve TB 72 gibi saf ve özgül antijenlerin saptanmas ı amaçlanmaktad ı r. Vucüt s ı v ı lar ı nda özgül antijenlerin RIA ve ? ELISA ile gösterilmesinin duyarl ı l ığı %39-79 ve özgüllü ğ ü %98-100 olarak belirlenmi ş tir. Bu konudaki çal ı ş malar yo ğ un ş ekilde devam etmektedir. QuantiFERON®-TB Gold In- Tube (IT) test ESAT-6, CFP-10 ve TB7.7(p4) proteins ? karş oluşan interferon- ? (IFN- ? ) y ELISA ile ölçülmektir. Bu test BCG suşu ve diğ er tuberkuloz ? dş mikobakterilerde olmamas tanda önemlidir Latent M. tuberculose tansnda tedavi ? takibinde de önerilmektedir.Antimikobakteriyal duyarl ı k testleri Geleneksel yöntemler ? (Broth dilüsyon ve agar dilüsyon yötemleri BACTEC duyarl ı l ı k testi ? E test yöntemi ? PCR ile genetik ? mutasyonlar ı n saptanmas ıTedavi Tüberküloz tedavisi uzun ve kombine ilaçlarla ? olas ı d ı r. Tedavi ş ekli klinik forma ve hastaya göre ? de ğ i ş ir. Antitiberkülotik ilaçlar: en s ı k kullan ı lan ? izoniasid, rifampisin, etanbutol, prazinamid ve streptomysin yan ı nda daha nadir kullan ı lan sikloserin, ethionamid, kanamisin, kapreomisin, paraaminosalisilik asit Epidemiyolojisi Dünyada ? Tüberküloz günümüzde en yayg ı n görülen ? infeksiyonlardan Dünya nüfusunun 1/3 ’ ünü olu ş turan 1.7 milyar ki ş inin ? tüberküloz basili ile infekte oldu ğ u Hastalar ı n %95 ’ i geli ş mekte olan ülkelerdedir. ? HIV infeksiyonu birçok ülkede tüberkülozlu hasta ? say ı s ı n ı n belirgin ş ekilde artmas ı ndan ve ilaçlara dirençli su ş lar ı n olu ş mas ı ndan sorumludur Türkiyede tüberküloz: 19. yüzy ı ldan beri Osmanl ı İ mparatorlu ğ unu etkileyen ? tüberküloz salg ı n ı , 1900 lerden sonra Balkan sava ş ı ve onu izleyen 1. Dünya Sava ş ı nda yo ğ un yoksulluk sonras ı nda Anadolu ’ ya yay ı lm ı ş t ı r. 1940 y ı llar ı n ı n sonuna kadar en s ı k ölüm nedenidir. ? Devlet 1940 lar ı n sonlar ı nda verem sava ş ı için dipanserler aç ı lm ı ş t ı r. 1949 da kontrol program ı TBMM taraf ı ndan kabul ? edilmi ş tir. 1953 de UNICEF ile i ş birli ğ i ile a ş ı kampanyalar ı na ? ba ş lat ı lm ı ş t ı r. 1983 kadar 9 kez bu gerçekle ş mi ş tir. 1982 de hastal ı k ? prevalans ı n ı n binde 3.6 oldu ğ u görülmü ş tür. Korunma ve kontrol Korunmada en önemli olan a ş ı lanmad ı r. ? BCG a ş ı s ı (Bacille Calmette Guerin): Calmette ? ve Guerin, 1908 y ı l ı nda, M. Bovis ’ in 231 pasajdan sonra önce hayvanlara daha sonra insanlara deneyerek ara ş t ı rmac ı lar ı n ad ı na itifaten BCG a ş ı s ı (Bacille Calmette Guerin) ad ı n ı alan a ş ı halen kullan ı lmaktad ı r. Korunma ve kontrol Günümüzde a ş ı daha farkl ı kültür ortam ı nda (Sauton ? besiyeri) 12-14 kültürden avirulan a ş ı olarak haz ı rlanmaktad ı r. A ş ı yenido ğ an bebeklere yap ı l ı yor. BCG sol deltoid bölgeye intradermal olarak uygulan ı yor. A ş ı land ı ktan sonra 5-6 y ı l sonra PPD ile kontrol edilerek yenilenebilir. A ş ı n ı n en önemli komplikasyonu aksiler lenfadenittir. ? BCG a ş ı s ı ; immun sistemi bozuk olan, radyasyon ? tedavisi alan,antimetabolik ve steroid alan, ate ş li çocuklara, gebelere, deri infeksiyonu olan ki ş ilere yap ı lmaz.Sonuç olarak Mikobakterilerin klinik örneklerden ? tan ı mlamada her ne kadar yeni moleküler ve immunolojik yöntemler kullan ı lsada kesin tan ı halen kültür yöntemleridir. Bundan dolay ı kültür yöntemlerinin geli ş tirilmesine yönelik çal ı ş malar desteklenmelidir.