Genel Moleküler Lümenisans Spektrokopisi ( Floresans, Fosforesans, Kemilüminesans ) Teorik Bilgiler Analitik uygulamalar Moleküler Lüminesans Spektroskopisi (Floresans, Fosforesans, Kemilüminesans)Çalş ma ilkesi: Bu yöntemlerin her birinde, analit molekülleri, emisyon (floresans, fosforesans ve kemilüminesans) spektrumlar kalitatif veya kantitatif bilgiler sa ğlayacak şekilde uyar l r. FIoresans ve fosforesans, uyar lman n fotonlar n absorpsiyonu ile olmas bak m ndan benzerdirIer. Bunun bir sonucu olarak, bu iki olay, s kl kla daha genel bir terim olan fotolüminesans ile ifade edilir. Sonradan görülece ği gibi, floresans, floresanstan sorumlu elektronik enerji aktar m n n elektronun spininde bir de ği şiklik olu şturmamas ile fosforesanstan ayr l r. Bunun bir sonucu olarak, floresans hemen yok olan (<10 -5 s) bir lüminesans olup, k sa ömürlüdür. Buna kar ş l k fosforesans emisyonlar ile ili şkili elektron spinindeki bir de ği şme, ş nlaman n bitmesinden sonra kolayca tespit edilebilir bir süre kadar, genellikle birkaç saniye veya daha uzun, ş man n sürmesine sebep olur. Bir çok durumda, floresans veya fosforesans olarak foto lüminesans emisyonu, onu uyarmak için kullan lan ş man nkinden daha uzun dalga boyundad r. Lüminesans n üçüncü tipi olan kemilüminesans, bir kimyasal reaksiyon sonucu olu şan uyar Imş bir türün emisyon spektrumuna dayan r. Baz durumlarda, uyar Imş tür, analit ve uygun bir reaktif (ozon veya hidrojen peroksit gibi kuvvetli bir yükseltgen) aras ndaki bir reaksiyonun ürünüdür. Bu durumda sonuç, analitin kendisinden çok, analitin veya reaktifin yükseltgenme ürününün karakteristik bir spektrumudur. Di ğer durumlarda analit, kemilüminesans reaksiyonunda do ğrudan yer almaz; bunun yerine, analitin bir kemilüminesans reaksiyonuna olan yava şlat c veya katalitik etkisi analitik parametre olarak i ş görür. Fotolüminesans veya kemilüminesans n şiddetinin ölçümü, eser miktarlardaki önemli baz inorganik veya organik türün kantitatif tayinini mümkün k lar. Günümüzde, florimetrik yöntemlerin say s , fosforesans ve kemilüminesans yöntemlerinin uygulamalar n n say s ndan önemli ölçüde daha fazlad r. NO + O 3 ? NO 2 * + O 2 NO 2 * ? NO 2 + h ? (600 - 2800 nm) FLORESANS ve FOSFORESANS Floresans basit veya karma ş k gaz, s v ve kat kimyasal sistemlerde meydana gelir. Floresans n en basit tipi, seyreltik atomik buharlar n gösterdi ği floresanst r. Örne ğin, buhar halindeki sodyum atomlar n n 3s elektronlar , 589,6 ve 589 nm lik dalga boylar ndaki ş nlar n absorpsiyonu ile 3p enerji seviyesine uyar labilir. 10 -5 - 10 -8 s sonra, elektronlar temel duruma geri döner ve her yöne do ğru, ayn iki dalga boyunda ş n yayar. Frekansta de ği şiklik olmaks z n absorplanan ş n n yeniden yay lmas n kapsayan floresans n bu tipi rezonans ş mas veya rezonans floresans olarak bilinir. Birçok moleküler tür, rezonans floresans da gösterir. Bununla beraber çok s k olarak, moleküler floresans veya fosforesans bantlar rezonans çizgisinden daha uzun dalga boylar nda merkezlenmi ş olarak bulunur. Bu uzun dalga boylar na veya dü şük enerjilere kayma stokes kaymas olarak ifade edilir.Uyar lmş elektronik halin enerji kaybetmesi, fosforesans yoluyla da olabilir. Triplet bir halde sistemler aras geçi şten sonra, iç veya dş dönü şüm veya fosforesans ile biraz daha sönüm olabilir. Bir triplet ? singlet geçi şi, singlet ? singlet dönü şümüne göre çok daha az mümkündür; bu nedenle, uyar lmş triplet halin ortalama ömrü, emisyona göre 10 -4 s den 10 s ye veya daha fazla süreye kadar olabilir. Böylece, böyle bir geçi şten kaynaklanan emisyon, ş nlanma kesildikten sonra biraz daha sürebilir. Elektronun Spini Pauli dş lama prensibi, bir atomdaki iki elektron için dört kuantum say s n n hepsinin birden ayn olamayaca ğ n belirtir. Bu s n rlama, bir orbitalde iki elektrondan daha fazla elektron bulunmamas n ve ayr ca iki elektronun da z t spinli olmas n gerektirir. Bu şartlar alt nda, spinler e şle şmi ştir. Spin e şle şmesi sebebiyle, moleküllerin ço ğu net manyetik alan göstermez ve bu yüzden diamanyetik olarak adland r l r. Yani bunlar, durgun manyetik alan taraf ndan ne çekilir ne de itilirler. Buna kar ş l k, e şle şmemi ş elektronlar içeren serbest radikallerin bir manyetik momenti vard r ve bunun sonucu olarak bir manyetik alan taraf ndan çekilir. Bu yüzden serbest radikaller paramanyetik olarak adland r l r. Singlet/ TripIet uyar Imş Haller Bütün elektron spinlerinin e şle şmi ş oldu ğu bir moleküler elektronik hal; bir singlet hal olarak adland r l r ve molekül bir manyetik alana maruz b rak ldğ nda elektronik enerji seviyelerinde hiçbir yar lma meydana gelmez. Di ğer taraftan, bir serbest radikal için temel hal bir dublet halidir. Çünkü, tek elektronun bir manyetik alan içinde, sisteme çok az farkl enerjilerde katk yapan iki yönlenmeye sahip oldu ğu kabul edilebilir. Bir molekülün bir çift elektronundan biri daha yüksek bir enerji seviyesine uyar l rsa ya bir singlet ya da bir triplet hal meydana gelir. Uyar lmş singlet halde, uyar lmş elektronun spini hala temel haldeki elektron ile e şle şmi ş durumda, bununla beraber, triplet halde, iki elektronun spinleri e şle şmemi ş durumda ve böylece paralel durumdad rlar. Se ç im Kurallar S ?? S T ?? T S ? / ? T Uyar lmş triplet haldeki bir molekülün özellikleri, uyar lmş singlet halindekinden önemli derecede farkl d r. Örne ğin, bir molekül triplet halde paramanyetik iken, singlet halde diamanyetiktir. Bununla beraber, daha da önemlisi, elektronun halindeki bir de ği şmeyi de kapsayan, singlet triplet geçi şinin, kar ş gelen, singlet singlet geçi şine göre önemli derecede daha az mümkün olmas gerçe ğidir. Bunun sonucu olarak uyar lmş triplet halinin ortalama ömrü 10 -4 s den birkaç saniyeye kadar uzayabilir. Bir uyar lmş singlet halin ortalama ömrü ise 10 -5 10 -8 s kadard r. Ayr ca, temel haldeki bir molekülün ş nla, bir uyar lmş triplet hale uyar lmas , dü şük olas lğ a sahiptir ve bu i şlem sonucu olu şan absorpsiyon pikIerinin şiddeti, benzer şekilde singlet-singlet geçi şine kar ş gelenlerinkinden bir kaç ondal k kat mertebesi kadar daha dü şüktür. Baz moleküllerin, bir uyar lmş singlet halinden bir uyar lmş triplet hale geçebilmesiyle fosforesans olu şur. En alttaki koyu yatay çizgi, normal olarak singlet haldeki molekülün temel hal enerjisini göstermekte olup, S o ile gösterilmi ştir. Oda s caklğ nda, bu hal, bir çözeltideki moleküllerin hemen hemen tamam n n enerjisini gösterir. En üstteki koyu çizgiler, üç uyar lmş elektronik halin temel titre şim halleri için enerji seviyelerini göstermektedir. Soldaki iki çizgi, birinci (S 1 ) ve ikinci (S 2 ) elektronik singlet hallerini gösterir. Sa ğdaki tek çizgi (T 1 ) birinci elektronik triplet halinin enerjisini gösterir. Normal olarak, birinci uyar lmş triplet halin enerjisi, kar ş gelen singlet halin enerjisinden daha dü şüktür. Fotolüminesans molekülünün k smi bir enerji seviyesi diyagram (Jablonski Diyagram )Daha ince yatay çizgilerle gösterilen çok say daki titre şim enerji seviyesi, dört elektronik halin her biri ile ili şkilidir. Bu molekülün uyar lmas , biri uzun dalga boyunda (S o ? S 1 ) ve ikincisi de daha k sa dalga boyu) (S o ? S 2 ) civar nda merkezlenmi ş iki ş n band n absorpsiyonu ile meydana gelebilir. Uyar lma i şleminin, molekülün çok say da uyar lmş titre şim halinden herhangi birine dönü şü ile sonuçlandğ na dikkat ediniz. Triplet hale do ğrudan uyar lma da gösterilmemi ştir. Çünkü bu i şlem, multiplisitede bir de ği şmeyi gerektirir ve önceden de bahsedildi ği gibi bu geçi şin olma olas lğ dü şüktür bu tip dü şük olas l kla bir geçi şe yasaklanmş denir. Absorpsiyon ve Emisyon H zlar Bir fotonunun absorplanma h z çok büyüktür. Bu i şlem 10 -14 - 10 -15 s mertebesinde tamamlan r. Di ğer taraftan, floresans emisyonu önemli derecede daha yava ş h zda olu şur. Burada, uyar lmş halin ömrü, uyar lma i şlemine kar ş l k gelen absorpsiyon pikinin molar absorptivitesi ile ters orant l d r. Bu nedenle, 10 3 - 10 5 aralğ ndaki molar absorptiviteler için uyar lmş hallerin ömrü 10 -7 - 10 -9 s dir. Geçi ş olas lğ n n daha küçük oldu ğu zay f absorplay c sistemler için ömür, 10 -6 - 10 -5 s kadar uzun olabilir. Önceden de belirtti ğimiz gibi, tripletten singlete geçi şin ortalama h z , buna kar ş l k gelen singlet-singlet geçi şininkinden daha azd r. Bu nedenle, Fosforesans emisyonu 10 -4 ile 10 s veya daha fazla bir süre gerektirir. Uyar lmş bir molekül, temel haline birkaç mekanik basama ğ n bir birle şimi yoluyla dönebilir. Daha önceki şekilde (Jablonski Diyagram ) düz dü şey oklar n gösterdi ği gibi, 'bu basamaklar n ikisi, bir ş n fotonunun yay m n içeren floresans ve fosforesans”t r. Dalgal oklarla gösterilen di ğer sönüm basamaklar ş mas z olaylard r. Temel hale geçi şte en tercih edilen yol, uyar lmş halin ömrünü en az yapan yoldur. Bu yüzden, ş mas z geçi şlere göre floresans ile sönüm h zl ise, bir emisyon gözlenir. Di ğer taraftan, e ğer bir ş mas z yol daha büyük h z sabitine sahipse, floresans ya yoktur ya da çok dü şük şiddettedir.I ş mas z Geçi şler Titre şimle Durulma Şekilde görüldü ğü gibi, elektronik uyar lma s ras nda bir molekül birçok titre şim seviyesinden herhangi birine uyar labilir. Bununla beraber, çözeltide, a ş r titre şim enerjisi, uyar lmş türlerin molekülleri ile çözücü molekülleri aras ndaki çarpş malar sonucu hemen kaybedilir; sonuç, bir enerji aktar m ve çözücü s caklğ ndaki çok az bir artş t r. Titre şim enerji seviyeleri bak m ndan uyar lmş bir molekülün ortalama ömrü 10 -12 s veya daha az olup, bu süre elektronik olarak uyar lmş bir halin ortalama ömründen önemli derecede daha k sa oldu ğundan, titre şimle durulma i şlemi çok etkilidir. Sonuç olarak, çözeltiden floresans oldu ğu zaman, bu floresans daima uyar lmş bir elektronik halin en dü şük titre şim seviyesinden bir geçi ş ile ilgilidir. Bununla beraber, elektron, temel halin titre şim seviyelerinden herhangi birine dönebilece ği için, birbirine yak n birçok pik olu şur. Daha sonra, daha fazla titre şimsel durulma ile elektron, h zla temel elektronik halin en dü şük titre şim seviyesine dönecektir.İç Dönü şüm İç dönü şüm terimi, bir molekülün, ş n yaymadan daha dü şük bir elektronik enerji seviyesine geçmesi ile ilgili molekül içi olaylar ifade eder. Bu olaylar, ne tam olarak tan mlanmş ne de tam olarak anla ş lmş t r; fakat ba ğ l olarak çok az bile şi ğin floresans göstermesi bunlar n genellikle çok etkili olduklar n n aç k göstergesidir. Dş Dönü şüm Uyar lmş bir elektronik halin sönümlenmesi, uyar lmş molekül ve çözücü veya di ğer çözünenler aras ndaki etkile şimi ve enerji aktar lmas n içerebilir. Bu olaylara topluca dş dönü şüm veya çarpş ma ile sönüm denir. Dş dönü şüm için delil, çözücünün floresans şiddeti üzerindeki, kuvvetli etkisini içerir; ayr ca tanecilikler aras ndaki çarpş ma say s n azaltan ko şullar (dü şük s cakl k ve yüksek viskozite) genellikle floresans azalt r. Dş ve iç dönü şümler, fosforesans ile o kadar ba şar l bir şekilde rekabet ederler ki; normal olarak fosforesans emisyonu, sadece dü şük s cakl klarda ve çok viskoz ortamlarda veya kat yüzeyle absorplanmş moleküllerde gözlenir. UYARILMI Ş B İ R HAL İ N TEMEL HALE GE Ç MES İSistemler Aras Geçi ş Sistemler aras , geçi ş, uyar lmş bir elektronun spininin ters döndü ğü bir olayd r ve molekülün multiplisitesinde bir de ği şme olur. iç dönü şümde oldu ğu gibi, e ğer iki halin titre şim seviyeleri, örtü şürse/bu geçi şin olas lğ artar. Şekil de gösterilen singlet/triplet geçi şi buna bir örnektir; burada, en dü şük singlet titre şim seviyesi, daha yüksek triplet titre şim seviyelerinin biri ile örtü şmektedir ve böylece spin halinde bir de ği şme daha muhtemeldir. Sistemler aras geçi ş, iyot veya brom gibi a ğ r atomlar içeren moleküllerde çok yayg nd r. UYARILMI Ş B İ R HAL İ N TEMEL HALE GE Ç MES İKuantum Verimi Floresans veya fosforesans için kuantum verimi veya kuantum verimi oran basit olarak lüminesans yapan moleküllerin say s n n, toplam uyar lmş molekül say s na oran d r. Floresein gibi oldukça floresans bir molekül için baz şartlar alt ndaki kuantum verimi bire yakla ş r. Önemli derecede, floresans yapmayan kimyasal türler s f ra yak n verimlere sahiptir. a öa id dd s f f k k k k k k k ? ? ? ? ? ? ? a öa id dd s f f k k k k k k k ? ? ? ? ? ? ? a öa id dd s f f k k k k k k k ? ? ? ? ? ? ? k f = floesresans ba ğ l h z sabiti k s = sistemler aras ge ç i ş “ “ k dd = d ş d ö n üşü m “ “ k id = i ç d ö n üşü m “ “ k ö a = ö n ayr şma “ “ k a = ayr şma “ “ Floresans ve Fosforesans Etkileyen De ği şkenler Bir maddenin lüminesans yap p yapmayaca ğ na, hem moleküler yap hem de kimyasal çevre etki eder; lüminesans olurken bu faktörler, emisyon şiddetini de belirler. Floresansta 250 nm den daha küçük dalga boylar ndaki ultraviyole ş nlar n absorpsiyonun sonucu floresans n nadiren oldu ğunu bilmek önemlidir. Çünkü, bu tür ş malar, önayrş ma ve ayrş ma ile uyar lmş halin sönümüne sebep olmaya yetecek kadar enerjilidir. Örne ğin, 200 nm'lik bir ş n yakla ş k 140 kcal/mol'e kar ş l k gelir; birçok organik molekül bu büyüklükteki enerjiler ile kopart labilecek baz ba ğlara sahiptir. Sonuç olarak, ? ? ?* geçi şi sebebiyle olan floresans nadiren gözlenir; bunun yerine, böyle emisyon, daha az enerjili ? ? ?* ve n ? ?* geçi şleri ile s n rl d r.Floresans n; en dü şük enerji geçi şi ? ? ?* tipi olan bile şiklerde, en dü şük enerji geçi şi n ? ?* tipi olan bile şiklere göre daha fazla oldu ğu gözlenmi ştir. Yani, ? ? ?* geçi şi için kuvantum verimi daha büyüktür. ? ? ?* geçi şi ile ilgili olan daha büyük kuantum verimi iki yolla gerçekle şebilir: Birincisi, bir ? ? ?* geçi şin molar absorpsiyon katsay s n n normal olarak bir n ? ?* geçi şininkinden 100 ile1000 kat daha büyük olmas d r. Bu büyüklük her iki yöndeki geçi ş olas lğ n n bir ölçüsünü gösterir. Böylece, ? ? ?* geçi şi ile ilgili ömür daha k sa (bir n ? ?* geçi şi için olan 10 -5 - 10 -7 s ile kar ş la şt r ldğ nda 10 -7 - 10 -9 s kadar) ve E şitlik deki kf daha büyüktür. Kuantum Verimi ve Geçi ş TipiFloresans ve Yap En şiddetli ve en faydal floresans, dü şük enerjili ? ? ?* geçi şlerine sahip aromatik fonksiyonel gruplan içeren bile şiklerde görülür. Alifatik ve alisiklik karbonil gruplar n veya fazla say da konjüge çift ba ğl yap lar içeren bile şikler de floresans gösterebilir, ancak bunlar n say s aromatik sistemlerin say s ile kar ş la şt r ldğ nda daha azd r. Deri şim etkisi Floresans şiddeti F, dü şük deri şimlerde deri şim ile orant l d r. F=KC *Yüksek deri şimlerde kendi kendine sönüm ve kendi kendine absorpsiyon nedeniyle negatif sapma gösterir.Fenantren i ç in spektrumlar: E, uyarma F, floresans P, fosforesans 200 300 400 500 nm B a ğ l ş i d d e t Bir uyar lma spektrumu, uyarma dalgaboyu de ği ştirilirken, sabit dalgaboyunda lüminesans n ölçülmesiyle elde edilir (ayn şartlarda elde edilen absorpsiyon spektrumu ile ayn d r). Floresans ve fosforesans spektrumlar dalgaboyunun bir fonksiyonu olarak emisyon şiddeti kaydedilirken, sabit dalgaboyunda uyar lmay kapsar. Fotolüminesans genellikle uyarma dalgaboyundan daha uzun dalgaboylar nda olur. Ayr ca fosforesans bantlar floresans bantlar ndan daha uzun dalgaboylar nda olur. Çünkü triplet uyar lmş enerji seviyesi genelde singlet uyar lmş enerji seviyesinden daha dü şük enerjilidir. E F PFotolüminesans ölçülmesi için kullan lan cihazlar n çe şitli bile şenleri, ultraviyole görünür bölge fotometreleri veya spektrofotometrelerinde bulunanlarla benzerdir. Şekilde florimetreler ve spektroflorometrelerdeki bu bile şenlerin tipik bir dizili şi görülmektedir. Hemen hemen bütün floresans cihazlar nda güç kayna ğ ndaki dalgalanmalar dengelemek (etkisini gidermek) için çift- ş nl optik sistem kullan l r. Numuneden gelen ş n, önce floresans uyaracak ş nlar geçiren fakat floresans emisyonunun dalga boyundaki ş nlar dş ar da tutan veya s n rlayan bir uyar lma filtresinden veya bir monokromatörden geçer. Floresans numuneden bütün yönlere do ğru olur, fakat en uygun şekilde floresans uyarma ş n na dik aç dan gözlenir; di ğer aç larda çözeltiden ve hücre duvarlar ndan olu şan saç lma, şiddet ölçümünde büyük hatalara sebep olabilir. Yay lan ş n, ölçme için floresans ay ran ikinci bir filtreden veya monokromatörden geçtikten sonra bir dedektöre ula ş r. Referans ş n demeti ise, şğ n gücünü yakla ş k olarak floresans ş nlar nkine azaltan bir azalt c dan geçer (güç azalt lmas ekseriya 100 kat veya daha fazlad r). Referans ve numune fotoçogalt c tüplerden gelen sinyaller, sonra ç kt y bir metreye veya kaydedici ile gösteren bir fark yükselticisine gönderilir. FLORESANS ve FOSFORESANS ÖLÇÜMÜ İÇ İN C İHAZLARFiltreler ve monokromatörler Hem uyarma demetinin hem de olu şan floresans ş n n n dalga boyunun seçilmesi için, florometrelerde giri şim ve absorpsiyon filtrelerinin her ikisi de kullan lmş t r. Spektroflorometrelerin ço ğu, en az bir ve bazen iki optik a ğl monokromatör ile donat lmş t r. I ş k Kaynaklar Filtreli florometreler için en yayg n kullan lan kaynak, erimi ş silika pencereli, dü şük bas nçl civa buhar lambas d r. Bu kaynak, 254, 302, 313, 546, 578,691 ve 773 nm'deki uyarma floresans nda faydal çizgiler meydana getirir. Herbir çizgi, uygun absorpsiyon veya giri şim filtreleri ile di ğerlerinden ayr labilir. Floresans yapan birçok bile şikte, floresans çe şitli dalga boylar yla sa ğlanabildi ğinden, c van n en az ndan bir çizgisi normal olarak bu i ş için uygun olur. Demet zay flat c monokromat ö r foto ç o ğ alt c s monokromat ö rDedektörler Tipik lüminesans sinyali dü şük şiddetlidir; ölçülebilmeleri için yükseltilmeleri gerekir. Duyarl floresans cihazlarda fotoçogalt c tüpler en yayg n kullan lan dedektörlerdir. Bunlar, genellikle, art r lmş sinyal/gürültü oranlar elde etmek için foton say m modunda çalş t r l rlar. Sinyal/gürültü oranlar n art rmak için bazen dedektörlerin so ğutulmas da gerekir. Hücreler ve Hücre Bölmeleri Floresans ölçmeleri için cam veya silisden yap lmş hem silindirik hem de dikdörtgen prizmas şeklindeki hücreler kullan l r. Fosforesans ölçümünde, florometrelere uyarma ile fosferans n aral kl olarak ölçülmesini sa ğlayacak düzenek eklenir. Fosforimetre ile florometre aras ndaki fark budur.Analitik Uygulamalar Floresans ve fosforesans yöntemleri absorbansa dayal spektrofotometrik ölçümlerden daha dü şük deri şim aral klar na uygulanabilir. Yüksek duyarl k, ş k kayna ğ n n gücünü art rmak suretiyle sa ğlanabilir. Ancak fotolüminesans yöntemlerinin kesinlik ve do ğrulu ğu, absorpsiyona dayal spektrofotometrik yöntemlerden daha dü şüktür. Floresans olu şturan kompleksler olu şturularak, metal iyonlar n n analizi yap labilir. Florometik analizin organik ve biyokimyasal türlere çok say da uygulamas vard r. Florometrenin en önemli uygulamalar , g da ürünleri, ilaç, klinik numuneler ve do ğal ürünlerin analizidir. Fosforesans ve floresans yöntemleri birbirlerini tamamlama e ğilimindedirler. Çünkü, kuvvetli floresans yapan bile şikler zay f fosforesans, kuvvetli fosforesans yapan bile şikler de zay f floresans yaparlar. Örne ğin, biti şik halkal aromatik hidrokarbonlar aras nda, halojenler veya sülfür gibi daha a ğ r atomlar içerenler, genellikle kuvvetli olarak fosforesans yaparlar; di ğer taraftan, a ğ r atom içermeyen ayn tip bile şikler fosforesanstan daha çok floresans yapma e ğilimindedir.Fosforimetri, nükleik asitler, amino asitler; pirin ve pirimidin, enzimler, petrol hidrokarbonIar ve pestisitler gibi maddeleri de kapsayan çok çe şitli organik ve biyokimyasal türlerin tayini için kullan lmş t r. Bununla beraber, bu yöntem, florometri kadar yayg n kullan m aIan bulmamş t r. Bunun sebebi, dü şük s cakl klara ihtiyaç duyulmas ve fosforesans ölçmelerindeki daha zay f kesinlik olabilir. Di ğer taraftan, fosforesans i şlemlerinin potansiyel olarak daha yüksek seçicili ği cezbedicidir. Davranş taki bu fark n sebebi, etkili fosforesans n uyar lmş triplet haldeki molekül say s n art rmak için h zl sistemler aras geçi şe ihtiyaç duymas , dolay s yla uyar lmş singlet deri şimini ve böylece de fosforesans şiddetini azaltmas d r.Gözlenebilme s n r Lüminesans yöntemlerinin en cezbedici özelliklerinden birisi, absorpsiyon spektroskopisiyle kar ş la şt r ldğ nda bir ile üç ondal k mertebesinden daha küçük gözlenebilme s n rlar sa ğlayan kendilerine özgü duyarl klar d r. Pik gözlenebilme s n rlar milyarda bir (ppb) mertebesindedir. Fotolüminesans yöntemlerin di ğer bir üstünlü ğü, onlar n geni ş do ğrusal deri şim aralğ olup, bu da genellikle absorpsiyon yöntemlerine göre önemli derecede daha büyüktür. Yüksek duyarl klar sebebiyle, kantitatif lüminesans yöntemleri, s kl kla numune matriksinden kaynaklanan ciddi giri şim etkilerine maruz kal rlar. Bu sebepten dolay , lüminesans ölçmeleri genellikle çok iyi kromatografik ve elektroforez ay rma teknikleri ile birlikte kullan l r. Floresans dedektörler, s v kromatografi ve kapiler elektroforez için dedektör olarak, fevkalade duyarl klar sebebiyle, özellikle de ğerlidir. Genel olarak, lüminesans yöntemleri, kantitatif analizde absorpsiyon yöntemlerinden daha az uygulan r. Çünkü, ultraviyole/görünür ş n absorplayan türler, spektrumun bu bölgesinde ş n n absorpsiyonu sonucu olu şan fotolüminesans ndan çok daha fazlad r. KEM İLÜM İNESANS Kemilüminesans n analitik kimyaya uygulanmas son y llarda geli şmi ştir. Kemilüminesans olu şturan kimyasal reaksiyonlar n say s azd r ve bu yüzden i şlem ba ğ l olarak az say daki tür ile s n rl d r. Ancak, kemilüminesans vermek üzere reaksiyona giren bile şiklerin önemi, yüksek seçicilik, basitlik ve yöntemin a ş r duyarl lğ kullan m n son y llarda art rmş t r. Kemilüminesans Olay Bir kimyasal reaksiyon, temel haline dönerken, ş k yayan veya enerjisini daha sonra emisyon yapacak ba şka bir türe aktaran, elektronik olarak uyar lmş bir tür verdi ği zaman kemilüminesans meydana gelir. Kemilüminesans reaksiyonlar na çok say da biyolojik sistemde rastlan r ve bu olaya genellikle biyolüminesans ad verilir. Biyolüminesans gösteren türler için örnekler; ate şböce ği, deniz menek şesi ve baz deniz anas bakteriler, tek hücreli hayvanlar ve kabuklu hayvanlard r. Çe şitli do ğal biyolüminesans olaylar n n kimyas tam olarak anla ş lamamş t r. A + B ? C* + D C* ? C + h ?Kemilüminesans ölçüm cihazlar oldukça basittir ve sadece uygun bir reaksiyon kab ve bir fotoço ğalt c tüpten ibaret olabilir. Genel olarak, analit ile reaktif aras ndaki kimyasal reaksiyon oldu ğundan, dalga boyu seçici cihaza gerek yoktur. Zaman n bir fonksiyonu olarak, kemilüminesans deneyinden elde edilen tipik sinyal, reaktif ve analitin karş t r lmas tamamlandğ nda, h zla en yüksek de ğere ula ş r; sonra sinyalin daha az veya daha çok üstel bozunmas takip eder. Kantitatif analiz için genellikle sinyal sabit bir zaman periyodu için integre edilir ve ayn yolla i şlem görmü ş standartlar ile kar ş la şt r rlar. Alternatif olarak, pik yükseklikleri de kullan l r. Sinyal ve deri şim aras nda geni ş bir deri şim aralğ nda genellikle do ğrusal bir ili şki vard r. E m i s y o n Ş i d d e t i Zaman Analitik Uygulamalar Kemilüminesans yöntemleri genellikle yüksek duyarl lğ a sahiptirler. çünkü gürültü yoklu ğunda dü şük ş k seviyeleri bile kolayca izlenebilir. Ayr ca, bir filtre veya monokromatör ile ş n n zay flamas söz konusu de ğildir. Gerçekte gözlenebilme s n rlar genellikle dedektör duyarl lğ taraf ndan de ğil, reaktifin saflğ taraf ndan belirlenir. Tipik gözlenebilme s n rlar milyarda bir (bazen daha az) ile milyonda bir aralğ ndad r. Ozon, azot oksitler ve kükürt bile şikleri gibi atmosferik kirleticilerin tayini için yüksek duyarl l k ihtiyac sonucu, gaz bile şenlerinin tayini için kemilüminesans yöntemleri ortaya ç kmş t r. Bu yöntemlerin en yayg n kullan lanlar ndan biri, azot monoksit tayini için oland r; reaksiyonlar şöyledir: NO + O 3 ? NO 2 * + O 2 NO 2 * ? NO 2 + h ? (600 - 2800 nm) S v fazda analizlerde kemilüminesans gösteren organik maddeler yard m yla inorganik türlerin analizi yap l r. Kemilüminesans reaksiyonlar n n seçicili ğini art rmak ve yöntemi kemilüminesans reaksiyonlar nda do ğrudan yer almayan analitlere de uygulayabilmek için, istenen analitin substrat oldu ğu ve ürünlerden birinin kemilüminesansla tespit edildi ği bir enzim reaksiyonundan sonra bir, kemilüminesans basama ğ n n yürütülmesi yayg n bir uygulamad r.