Genetik Mühendisliğine giriş Nükleik Asit Hıbrıdızasyonuna Dayalı Yöntemler NÜKLEIK ASIT HIBRIDIZASYONUNA DAYALı YÖNTEMLE RHIBRIDIZASYON Nükleik asit hibridizayon (melezleme) yöntemleri; tek iplikli nükleik asit moleküllerinin tamamlayıcı dizileri ile uygun koşullar altında kendiliğinden eşleşerek çift iplikli hibrid moleküller (melezler) oluşturma özelliğine dayanır.? Hibridizasyon reaksiyonları tamamlayıcı nükleotid dizileri içeren tüm tek zincirli nükleik asit molekülleri arasında gerçekleşebilir. DNA/DNA RNA/RNA RNA/DNA ? Bu özgün reaksiyonlar, hem RNA hem de DNA molekülleri üzerindeki belirli nükleotid dizilerini belirlemek amacıyla kullanılır. ? Yöntemin uygulanması için, araştırılan nükleik asit dizilerine eşlenik olan tek iplikli nükleik asit (DNA veya RNA) dizilerine ihtiyaç vardır. ? Ayrıca bu dizilerin radyoaktif veya radyoaktif olmayan bir belirleyici ile işaretlenmesi gerekir. ? Ancak bu sayede hibridizasyon reaksiyonu sonucu oluşan çift iplikli molekül görülebilir hale gelir. ? Tanımlanmak istenen nükleik asit bölgesine eşlenik olan ve belirleyici olarak kullanılan tek iplikli özgün nükleik asit parçalarına prob adı verilir.YÖNTEM Belirli doku veya hücrelerden izole edildikten sonra jel elektroforezi ile ayrılan ve nitroselüloz veya naylon membranlara transfer edilen DNA moleküllerinin (Southern blotting) veya özgün RNA dizilerinin (Northern blotting) saptanması ve analizi için uygulandığı gibi, gerek RNA gerekse DNA dizilerinin belirli hücre veya dokulardaki varlığı ve dağılımını belirlemede (in situ hibridizasyon) de kullanılmaktadır.NÜKLEIKASITHIBRIDIZASYONU REAKSIYONUNUNTEMELLERI ? Çift iplikli bir nükleik asitin dayanıklılığı onun erime (melting temperature = Tm) sıcaklığını hesaplayarak belirlenir. Bu değer her bir organizma için farklıdır. ? Hibrid molekül ne kadar dayanıklı ise, Tm derecesi o kadar yüksektir, yani ipliklerin ayrılması için gereken enerji o oranda fazladır.HIBRID NÜKLEIK ASITLERIN DAYANıKLıLıĞı BIR TAKıM FAKTÖRLERE BAĞLıDıR 1.Guanin-sitozin oranı (%GC): GC çiftleri, 3 H bağı içerdiğinden, AT çiftlerine göre daha sağlamdır. Bu nedenle yüksek GC içeriğine sahip olan DNA, AT bakımından zengin olan DNA’ya nazaran daha dayanıklıdır ve iki ipliği ayırmak için daha çok enerji gereklidir. 2.Hibrid molekülün boyu: Genellikle uzun bir nükleik asit molekülü, kısa olana göre daha sağlamdır. Çünkü içerdiği hidrojen bağı sayısı daha fazladır. Böylece iki ipliği ayırmak için daha çok enerji gerekir. 3.Nükleik asitlerin içinde bulunduğu ortam: Hibridizasyon karışımı ve hibridizasyon sonrası yıkama solüsyonlarında, tek değerlikli katyonları içeren iyonik bir tuz tamponu içinde formamid bulunur. Formamid hidrojen bağlarını bozarak çift iplikli nükleik asitlerin çözülmesini kolaylaştırır. Bunun tersine Na + gibi tek değerlikli katyonların konsantrasyonunu artırmak hibridleri sağlamlaştırır. Organik çözücülerin çift iplikli polinükleotitlerin ısıya dayanıklılığını azaltarak daha düşük sıcaklıklarda hibridizasyona olanak vermesi bu problemi çözümlemiştir. Formamid bu amaçla kullanılan organik bir çözücüdür; DNA/DNA ve DNA/RNA çift ipliklerinin ayrılma sıcaklığını azaltır. Böylece hibridizasyon, %50 formamid varlığında 30-45°C’da gerçekleştirilebilir. Belirli formamid ve Na + konsantrasyonlarındaki bu solüsyonların sıcaklığı hibridizasyonun kesinliğini belirler.4.Nükleik asit hibridinin çeGidi: RNA/RNA hibridleri DNA/DNA hibridlerine göre ısıya daha dayanıklıdır. DNA/RNA hibridleri ise orta dayanıklılıktadır. 5. YanlıG eGleGen hibridlerin varlığı: Yanlış eşleşen nükleotitler (A-T yerine T-T vb.) hibridin dayanıklılığını azaltır. Çünkü bunlar arasında hidrojen bağları oluşamaz. Yanlış eşleşmenin dayanıklılığı azaltan etkisi, kısmen prob uzunluğuna bağlıdır. Çift iplikli hibrid ne kadar uzun ise yanlış eşleşmiş bir çiftin, hibrid dayanıklılığına etkisi o kadar azdır.IN SITUHIBRIDIZASYON ? In situ hibridizasyon (ISH), nükleik asit dizilerinin (DNA ve RNA) morfolojik olarak korunmuş kromozomlar, hücreler veya doku kesitlerinde saptanarak gösterilmesini sağlayan ve temel olarak çift iplikli nükleik asit oluşumu kinetiğini kullanan güçlü bir tekniktir. ? In situ hibridizasyonun diğer hibridizasyon yöntemlerinden (Southern veya Northern Blotting) farkı nükleik asitlerin kendi hücresel ortamlarında tanınarak gösterilmesidir. Böylece hedef nükleik asit dizisinin hücredeki yeri belirlenmiş olur. ? Nükleik asitlerin bulundukları yerde saptanması: Kromozomların fiziksel haritalarının yapılmasında, Kromozom yapı ve hatalarının analizinde, Kromozomların ve genomun yapı, işlev ve evriminin araştırılmasında, Gen anlatımının belirlenmesinde, Eşey tayininde, Dokudaki virüs ve bakterilerin tanısında, Transformasyon dizilerinin ve onkogenlerin yerlerinin belirlenmesinde önemlidir.In situ hibridizasyonun anlaşılması moleküler biyoloji, genetik, immünokimya ve histokimya bilgilerini gerektirmektedir. Yöntemin başlıca aşamaları yandaki gibidir. Biyolojik materyalin hazırlanması Probun işaretlenmesi Prob ve materyalin denatürasyonu Hibridizasyon Yıkama Saptama Görünür hale getirme? ISH yöntemi ilk kez 1969’da birbirinden bağımsız olarak çalışan iki grup araştırıcı tarafından (John ve ark., Pardue ve Gall) uygulandı. ? İlk uygulamalarda nükleik asitleri işaretlemede radyoizotoplar kullanılmaktaydı; buna göre hibritleşmiş dizileri göstermek için başvurulan tek yöntem otoradyografiydi. ? Ayrıca, o sıralarda moleküler klonlama mümkün olmadığından ISH sadece biyolokimyasal metotlar ile saflaştırılabilen ve izole edilebilen dizilere (fare satellit DNA’sı, viral DNA, ribozomal RNA vb.) uygulanabiliyordu. ? Nükleik asitlerin moleküler klonlaması ve radyoaktif işaretleme tekniklerindeki gelişmeler bu tabloyu önemli derecede değiştirdi. ? Öte yandan, radyoaktif olmayan işaretleyici ile hazırlanmış nükleik asit problarının ISH’da kullanılması radyoaktif yöntemin getirdiği zorlukları ortadan kaldırdı. ? Radyoaktif olmayan ISH ilk kez 1970’lerin sonunda uygulandı (Rudkin ve Stollar, 1977; Bauman ve ark., 1980). O günden beri radyoaktif olmayan in situ hibridizasyonun (NISH) biyomedikal araştırmalarda ve klinik tanıdaki uygulamaları büyük bir hız kazanmıştır.? Son yıllarda nükleik asitleri işaretlemek için birçok yöntem geliştirilmiştir. Günümüzde, biotin, digoksigenin, dinitrofenil veya fluorokromlarla enzimatik olarak işaretleme genellikle tercih edilmektedir. Piyasada çeşitli prob işaretleme kitlerinin bulunması, bu işlemleri oldukça kolaylaştırmıştır. ? Rekombinant DNA preparasyonları ile birlikte saf prob elde edilmesi sorunu çözülmüştür. Prob seçimine bağlı olarak, belirli genom ve kromozomlar, tekrarlanan DNA dizileri, tek kopyalı diziler, mRNA ve viral diziler gibi farklı hedefler saptanabilmektedir. ? Çeşitli sitokimyasal saptama yöntemlerinin geliştirilmesi de ISH tekniğinin başarısını arttırmıştır. Birden fazla prob işaretleme ve saptama yönteminin birlikte kullanılması aynı hücre preparatında iki veya daha çok nükleik asit dizisinin farklı renklerde gösterilmesini sağlamıştır. ? Ayrıca radyoaktif olmayan ISH ile immünositokimyasal yöntemin birlikte kullanılması gen topografisi ile gen aktivitesi arasındaki ilişkinin DNA, mRNA ve protein düzeyinde ortaya konulmasına olanak vermiştir.InsituHibridizasyon Problarının Seçimi ISH’da kullanılacak probların seçilmesinde iki temel nokta vardır: Prob olarak kullanılacak nükleik asitin tipi ve uygun işaretleme cinsi Prob tipleri Prob olarak hazırlanan nükleik asitler; çift iplikli DNA (dsDNA), tek iplikli DNA (ssDNA), tek iplikli RNA ve oligonükleotitler olarak sınıflandırılabilirler (Tablo).Probtipi Avantajları Dezavantajları RNA RNA:RNA melezleri oldukça dengelidir. Prob denatürasyonu gerekmez. Hibridizasyon işlemi sırasında yeniden eşleşme olmaz. Prob vektör içermez. Hibridizasyon sonrası RNaz uygulaması hibritleşmeyen probları ortadan kaldırır. Probun RNaz aktivitesinden korunması gereklidir. Çok çabuk parçalanır. Probun vektör içine altklonlanması gerekir. dsDNA Altklonlama gerektirmez. Fazla sayıda ve uygun işaretleme yöntemleri uygulanabilir. Prob denatürasyonu gerekir. Hibridizasyon sırasında tamamlayıcı iplikler yeniden eşleşir. Hibridler RNA problarından daha az dengelidir. Oligonükleotitler Klonlama gerektirmez. Kendi içinde eşleşmeye uğramaz. Dokuya penetrasyonu çok iyidir. Protein dizilerinden yararlanarak hazırlanabilir. Sınırlı işaretleme yöntemi uygulanır. Dizileme sırasında hatalar oluşabilir. Hibridizasyon için oldukça kısa dizilerdir.? Her prob çalışılacak materyale ve araştırıcının moleküler biyoloji deneyimine bağlı olarak seçilir. ? Kromozomlar üzerinde gerçekleştirilen ISH’da ve viral DNA tayinlerinde genellikle DNA probları, mRNA tayinlerinde ise tek iplikli RNA probları veya oligonükleotitler tercih edilmektedir. ? Problar parça-izolasyon, klonlama, in vitro transkripsiyon veya kimyasal sentez yolu ile elde edilebilirler.PROBUZUNLUĞU ? Maksimum hibridizasyon oranı uzun problar ile elde edilir. ? Ancak ISH’da kısa problar gereklidir. Çünkü, probun hücre veya kromozomlar çevresindeki yoğun matriksten geçerek hedefe ulaşması gerekmektedir. ? Probların 50-150 bazlık olanları birçok doku için en iyi sinyali verir. ? Çok kısa problar ise çok zayıf sinyaller verirler, bazen de istenmeyen işaretlere neden olabilirler. Bununla beraber probun optimum boyu çalışmaya göre değişir. ? Örneğin, paraformaldehit ile fikse edilmiş ve parafine gömülmüş embriyo için, ISH çalışmalarında optimum sinyal 1 kb boyutundaki RNA probları ile elde edilir. ? Dokunun özelliği, fiksasyon tipi, hibridizasyon öncesi işlemlerinin uygulanıp uygulanmamasına göre de prob uzunluğunun seçimi değişir. ? Oligonükleotitler tek iplikli oluşları ve çok iyi penetrasyon özelliklerine sahio olmalarından dolayı ISH için oldukça avantajlı problardır. Ancak küçük boyutlu olduklarından, hedef nükleik asidin ancak küçük bir bölümü ile eşleşirler.PROBUN GgARETLENMESI GZOTOPIK GgARETLEME GZOTOPIKOLMAYAN GgARETLEME Gzotopik GGaretleme ? İşaretleme radyoaktif madde ile yapılır ve işaretin belirlenmesi için otoradyografi kullanılır. ? Reaksiyonun sonucunun hızına, prob stabilitesine ve çalışılan konuya göre farklı tipte izotoplar kullanılır. ? H 3 işaretli problar; subsellüler uygulamalar için kullanılır, yüksek çözünürlüğe (0,5-1 µm) sahiptir. İşaretli problar birkaç yıl saklanabilir. ? S 35 ISH’da en yaygın olarak kullanılan radyoaktif işaretlemedir. S 35 işaretli problar, özellikle hücresel uygulamalar için uygundur. Otoradyografi işlemi 1 hafta sürebilir. İşaretli prob birkaç ay içinde tüketilmelidir. Çözünürlüğü 10-15 µm kadardır. ? P 32 , geniş çaplı alanlar için uygulanır. Çözünürlük 20-30 µm’dir. İşaretli problar bir hafta içinde kullanılmalıdır.Gzotopik Olmayan GGaretleme ? İşaretleme radyoaktif olmayan maddelerle yapılır ve işaretin tayini için immünohistokimyasal yöntemler kullanılır. ? Son yıllarda izotopik olmayan işaretlemeler daha sıklıkla kullanılmaktadır. ? İzotopik olanlara göre avantajları, işaretli probların 6 ay veya daha uzun süreli olarak -20°C’da saklanabilmesi, çözünürlüğün yüksek olması, hızlı sonuç alınması, daha fazla sayıda işaretleme yöntemi bulunması ve daha güvenilir olmasıdır. ? Dezavantajları ise; duyarlılığın izotopik işaretlemelerden daha az olması ve istenmeyen bağlantılara daha fazla yol açabilmesidir.? Prob işaretlemeleri kimyasal veya enzimatik reaksiyonlar ile yapılır. ? En yaygın kullanılan işaret maddeleri biotin, digoksigenin gibi haptenler ve FITC (fluoresein) gibi fluoresan maddelerdir. Ayrıca, ender olarak peroksidaz, alkalin fosfataz gibi enzim işaretlemelerine de rastlanır. ? Hapten işaretli problar mRNA ISH için güvenilirlik, yüksek stabilite, hızlı sonuç verme ve tek hücre çözünürlüğü gibi önemli avantajlara sahiptirler. ? En duyarlı yöntem, özgün bir antikora uygun olan bir haptenin, bir nükleotit türevine bağlanması ile gerçekleştirilir (örneğin, digoksigenin ddUTP veya dUTP’ye bağlanır). Hibridizasyon ve yıkamaları takiben doku bir enzime bağlı olan ve hapteni bağlayan bir protein ile inkübe edilir. Daha sonra sinyal bu enzim için uygun substratın kullanılması sonucunda, ürünün renklendirilmesi şeklinde elde edilir. Bu işlem fluoresein işaret maddesinin kullanımı için de benzer şekildedir. İşaret fluoresan mikroskobunda gözlenir.IN SITUHIBRIDIZASYONDAKONTROL ? ISH deney sonuçlarının doğru olarak yorumlanabilmesi ve güvenilirliği açısından çok dikkatli davranılmalı ve işlem sonuçlarından emin olmak için çeşitli kontroller yapılmalıdır. ? Hibridizasyon reaksiyonlarında, problar ile hedef olmayan nükleik asit dizileri arasında, olası homolojilerden dolayı istenmeyen sonuçlar ortaya çıkabilir. ? Ayrıca probun G-C bakımından zengin bölgeleri ile hedef olmayan nükleik asitler arasındaki hibridizasyon da yanlış pozitif sonuç verebilir. ? Böyle hatalı hibridizasyon reaksiyonlarının önlenmesi için prob dizisinin çok dikkatli seçilmesi ve kontrol probların kullanılması gereklidir. ? Hibridizasyon öncesi uygulamalarda yer alan RNaz veya DNaz ile sindirme DNA veya RNA gibi hedef nükleik asitlerin varlığının saptanmasında önemli bir kontroldür. ? Enzim uygulamaları çok dikkatli yapılmalıdır. Nükleaz uygulamasından sonra, hedef nükleik asitin ortadan kaldırılmasını takiben, eğer enzim dokudan tam olarak giderilmemiş ise daha sonraki aşamada probu da sindireceğinden hibridizasyon sinyali çok zayıf olur veya gözlenemez.? İstenmeyen hibridizasyon sinyallerinin bir kısmı da probların spesifik olmayan hücresel bölgelere bağlanması ile ortaya çıkabilir. Bu duruma, proteinler ile prob arasındaki elektriksel çekimlere yol açabilir. Bir diğer prob-protein ilişkisine DNA’ya bağlanan proteinler neden olabilir. Bu gibi özgün olmayan ilişkiler, hücresel nükleik asitlerle hibritlenmeyen negatif kontrol problar kullanılarak ortadan kaldırılabilir. ? Bunlara ek olarak, histokimyasal veya immünohistokimyasal tekniklerdeki bir hata sürpriz pozitif sonuçlar doğurabilir. Bu da prob içermeyen hibridizasyon tamponu ile inkübe edilen kesitlere işaret tayin sistemlerinin uygulanması ile kontrol edilebilir. Ayrıca immünolojik tayin sistemlerinde kullanılan enzimlerini dokuda endojen olarak varlıkları dikkate alınmalı; gerekirse bir başka enzim seçilmeli ya da prehibridizasyon aşamasında endojen enzim maskelenmelidir. ? Kontrol probları olarak hedef gene karşı anlamlı (sense) veya anlatım yapmayan bir gene ait karşı anlamlı (antisense) oligonükleotitler, ayrıca rastgele dizili oligonükleotitler ve oligo d(T) veya d(A) kullanılabilir. Oligo d(T) probları, dokudaki mRNA’nın korunmuşluğu ve hücresel aktivitesi hakkında önemli bilgi veren poliadenil-RNA’ları tayin etmek için kullanılır. Bu aynı zamanda ISH protokolünün optimizasyonunda kullanılan bir adımdır.SOUTHERNBLOTTING ? İstenilen bir genin veya DNA dizisinin, binlerce baz çiftlik bir DNA molekülündeki varlığının belirlenmesi, moleküler biyoloji ve rekombinant DNA teknolojisi çalışmaları için önemli ve vazgeçilmez işlemlerden biridir. ? Özellikle gen yapısı, gen ifadesi, genom organizasyonu, haritalama ve gen aktarımı çalışmalarında (transformantların istenilen geni taşıyıp taşımadığının, kopya sayısının analizi vb) aranılan DNA dizisinin saptanması Southern blotting tekniği ile mümkün olabilmektedir. ? Bu teknik ilk kez adını aldığı Southern tarafından 1975 yılında tanımlanmıştır. ? Tekniğin temeli, istenilen DNA parçasının ona tamamlayıcı olan radyoaktif veya radyoaktif olmayan bir takım belirleyicilerle işaretlenmiş olan problar kullanılarak hibridizasyonuna ve hibridizasyonun ardından belirleyicinin özelliğine göre radyoaktif, immünolojik, kimyasal ya da fluoresan yöntemlerle görünür hale getirilmesine dayanır.Probların (tanımlamak istenilen nükleik asidin tamamlayıcısı olan özgün DNA ya da RNA parçaları) işaretlenmesinde son yıllara kadar belirleyici olarak P 32 , S 35 ve H 3 radyoizotopları yaygın bir şekilde kullanılmış ve radyoaktivitenin belirlenmesi için otoradyografiden yararlanılmıştır. Otoradyografinin hızlı sonuç vermesi, güvenilirliği gibi üstün özelliklerinin yanısıra radyoaktif maddelerle çalışmanın getirdiği zorluklar ve tehlikeler sistemin en önemli dezavantajını oluşturmaktadır. Bu durum araştırıcıları daha tehlikesiz yöntemler geliştirmeye yöneltmiştir. Bu yöntemlerin tümünün ortak özelliği işaretlemenin radyoaktif olmayan belirleyicilerle yapılmasıdır. Radyoaktif olmayan işaretleme ve belirleme sistemleri; Digoksigenin-anti-digoksigenin sistemi, Yabanturpu (Armoracia lapathifolia, horseradish) peroksidaz sistemi, Biotin-streptavidin sistemidir. Bu üç sistemle de hibritlenen probun belirlenmesi kromogenik (kolorimetrik) yani renkli bir ürün oluşturan veya ışık oluşumuna neden olan (kemoluminogenik) substratlar kullanılarak gerçekleştirilir.PROBUN HAZıRLANMASı VE IgARETLENMESI ? Prob hazırlamak, istenilen DNA fragmentinin kalıp olarak kullanılması ve ona tamamlayıcı DNA zincirinin in vitro sentez edilmesi demektir. ? Probların işaretlenmesi, probun cinsine göre farklı şekillerde yapılır. ? DNA probları; ‘random primed’ işaretleme 1 , ‘nick translation’ 2 veya Taq DNA polimeraz 3 ile işaretlenir. 1 ‘Random primed’ iGaretleme: In vitro DNA sentezi sırasında yeni sentez edilen probun yapısına rastgele biçimde DIG-11-dUTP’ler girer. 2 ‘Nicktranslation’: DNaz I enzimi ile çift iplikli DNA’nın tek ipliğinde kesikler oluşturma esasına dayanır. E.coli DNA polimeraz I enziminin 5’-3’ eksonükleaz aktivitesi ile tek iplik üzerinde kesik noktalar genişletilir ve boşluklar aynı anda enzimin 5’-3’ polimeraz aktivitesi ile ve DIG işaretli dNTP’lerle doldurulur. 3 Taq DNA polimeraz ile iGaretleme: PCR ile prob DNA’sı çoğaltılırken Taq DNA polimeraz enziminin diğer dNTP’lerin yanısıra DIG işaretli dNTP’leri de kullanmasıyla işaretleme gerçekleştirilir.? RNA probları; T3, T7 ve SP6 RNA polimerazları ile in vitro transkripsiyon reaksiyonu ile sentezlenirken ortama katılan DIG-11-dUTP ile işaretlenir. ? Oligonükleotit problar; terminal transferaz enzimi ile ya 3’ uca bir DIG-11-dUTP veya DIG-11-dUTP’den oluşan bir kuyruk eklenmesi ile ya da digoksigenin- NHS-esterin 5’ uca eklenmesi ile işaretlenir.? Problar hazırlandıktan sonra hibridizasyon için istenilen DNA parçası açısından taranacak DNA, eğer plazmid DNA’sı ya da genomik DNA gibi kompleks özellikte ise önce bir restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesilerek daha küçük parçalara bölünmelidir. ? DNA parçaları, agaroz jel elektroforezi ile birbirinden ayrıldıktan sonra nitoselüloz membrana aktarılır. ? Daha sonra da hazırlanan DIG işaretli probla hibridizasyona bırakılır. ? Probla nitroselüloz membran üzerindeki DNA parçalarından tamamlayıcısı olan arasında H bağları oluşumu ile çift zincirli DNA parçası meydana gelir.? Bundan sonraki aşamada prob ile hibritlenmiş DNA parçasının belirlenmesi gerekir. ? Bir hapten olduğu daha önce belirtilen digoksigenine karşı özgül digoksigenşn antikoru, alkalin fosfataz enzimi ile bağlı olarak bulunur. ? Hibridizasyon işleminin ardından ortama eklenen anti- digoksigenin (digoksigenin antikoru), probların yapısında bulunan dUTP’lere bağlı digoksigenin ile bir antijen-antikor kompleksi oluşturur. ? Bu kompleksin oluşumunu takiben ortama katılan ve alkalin fosfataz enziminin substratları olan ‘nitroblue tetrazolium’ tuzu (NBT) ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (X-fosfat) varlığında enzim aktivite gösterir. ? Sonuçta mavi renkli bir ürün oluşumu sayesinde istenilen DNA parçası belirlenmiş olur.ELECTROBLOTTING ILESOUTHERNAKTARıMı ? DNA parçalarının, özellikle de restriksiyon enzim kesimi uygulaması ile oluşan, boyutları birbirine çok yakın ve çok sayıda olanların, agaroz jeldeki bantları kısa sürede difüzyonla kaybolabileceğinden ve/veya agaroz jel kolayca kırılıp parçalanabileceğinden hibridizasyon amacıyla jeli kullanmak uygun değildir. ? Bu nedenle agaroz jeldeki DNA parçaları electroblotting ile bir membrana (örneğin nitroselüloz membrana) aktarılır. Böylece DNA parçaları membran üzerinde tutuklanmış (immobilize edilmiş) olur.NORTHERNBLOTTING ? İlgilenilen genin transkripsiyon ürünü olan RNA’nın analizinin yapılmasında kullanılan başlıca yöntemlerden biri DNA-RNA hibridizasyonudur. ? Northern hibridizasyonu olarak adlandırılan bu yöntemde önce total RNA agaroz jelde yürütülerek RNA moleküllerinin ayrılması sağlanır. ? Daha sonra jelde ayrılmış RNA molekülleri membrana aktarılır ve RNA’nın membran üzerine sabit şekilde bağlanması sağlandıktan sonra uygun problarla hibridizasyon işlemi gerçekleştirilir. ? Membranlar genellikle naylon veya nitroselüloz yapıdadır. ? Nötr, negatif veya pozitif yüklü olabilirler. ? Northern hibridizasyon için genellikle tercih edilen naylon membrandır fakat organik çözücüler etkisinde bırakıldığında küçülebilir veya katlanabilir. ? Nitroselüloz membranlar ise fiksasyon işlemindeki fırınlama sırasında yanabilir ve/veya yıkama sırasında kolayca yırtılabilir.