Genetik Mühendisliğine giriş sekans teknikleri SEKANS TEKNİKLERİDNA Dizi Analizi için geliştirilen birbirinden farklı iki yöntem bulunmaktadır. Bu iki yöntem; 1- Maxam ve Gilbert?in kimyasal kırılma yöntemi (Maxam et al.,1977). 2- Sanger-Coulson?un zincir sonlanma yöntemi. (Sanger et al.,1977). a-) Manuel (Radyoaktif İşaretleme) Dizi Analizi b-) Otomatik (Fluoresan İşaretleme) Dizi AnaliziSanger-Coulson Zincir Sonlanma Yöntemi DNA dizi analizinde en sık kullanılan yöntem Fred SANGER ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem olan zincir sonlanma yöntemidir (Sanger et al., 1977). Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve günümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizi tekniğidir. Yöntemin temeli DNA polimerazın dNTP? lerin (deoksiribonükleozit trifosfat) yanısıra deoksiribozun 3? pozisyonunda OH grubu taşımayan ddNTP? leri de (dideoksiribonükleozit trifosfat) substrat olarak kullanabilmesine dayanır. Sentezlenen DNA? ya bir ddNTP? nin katılması 3? pozisyonunda OH grubu olmadığı için sentezi durdurur.dATP ddATPDizi analizi yapılırken dört ayrı reaksiyon karışımı hazırlanır. Her bir karışım kalıp DNA zinciri, bir primer, dNTP? lerin dördü ve az miktarda ddNTP? lerden birini içerir. Özgül zincir sonlanması için her bir reaksiyonda farklı bir ddNTP bulunur. Reaksiyonların her birinde çok az miktarda modifiye nükleotit kullanıldığı için yeni zincir sentezi rastgele sonlanarak bir dizi DNA fragmenti meydana gelir (Klug et al., 2000).Reaksiyonlar sonucu elde edilen DNA parçalarına elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana yürütülür. Uygulanan elektriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en kısası en önde olmak üzere jel üzerinde bir merdiven görüntüsü oluşturur. İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde, tespit edilen parçacıklar reaksiyon karışımına konulan ddNTP? nin tipine göre okunur (Klug et al., 2000).Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yönteminde Kullanılan Kimyasallar Primerler Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde istenilen DNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi için özgül oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır. Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA?nın genomik DNA?dan eldesinde, çoğaltılmasında kullanılır. Ayrıca primerler yöntemin son aşaması olan sonlanma reaksiyonunda polimeraz enzimi için uygun 3? ucu sağlar. Her iki reaksiyondaki primer çifti aynı olabileceği gibi farklı primerler de kullanılabilir.Kalıp DNA Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde hem çift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir. Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincir reaksiyonu tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır. PCR ürünü kalıp DNA, önce reaksiyon artıklarından arındırılmalıdır. Bu çok özen gösterilmesi gereken bir aşamadır. Eğer kalıp DNA yeterince temizlenemezse bir sonraki sonlanma reaksiyonuna aktarılacak olan kimyasallar ile primer artıkları reaksiyonun hassasiyetini bozacaktır (Sambrook et al., 1989).Enzimler Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde bir çok tip DNA polimeraz enzimi kullanılabilmektedir. Bu enzimlerin ortak özellikleri özgül ve hassas olmalarıdır.E.coli Klenow Fragmenti DNA Polimeraz I İlk geliştirilen yöntemde kullanılan bu enzimin iki büyük dezavantajı vardır. Birincisi enzimin kontrolsüz olarak çoğaltma reaksiyonlarını yarıda kesmesidir. Özellikle uzun okumalarda bu problem iyice belirginleşmektedir. İkincisi enzimin homopolimerik bölgeler ile ikincil yapısı kuvvetli olan bölgelerde istenilen verimde çalışmamasıdır (Sambrook et al., 1989).Reverse Transcriptase Reverse transcriptase enziminin her ne kadar çok yaygın bir kullanım alanı olmasa da özellikle homopolimerik bölgelerde etkin çözüm verir. Enzim özellikle bu tip bölgelerde Klenow fragmentinden daha etkin ve kullanışlıdır (Sambrook et al., 1989).Sequenase Enzimleri Sequenase enzimleri T7 bakteriofajın?dan elde edilirler. Enzimin 3?-5? ekzonükleaz aktivitesi inhibe edilmiştir. İnhibe edilen bu özelliği sayesinde enzim tek yönlü ve hızlı çalışır. Kalıp DNA? nın uzun olduğu deneylerde yüksek özgül aktivitesi ve dayanıklılığı ile tercih edilir (Sambrook et al., 1989).Taq DNA Polimeraz Özellikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasında tercih edilir. Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygın kullanılan enzim türüdür. Özellikle 95 0 C? da aktif olması nedeni ile homopolimerik bölgelerde bile çok etkindir (Sambrook et al., 1989).Manuel DNA Dizi Analizi Sekans reaksiyonu kullanılarak zincir sonlandırma metodu uygulanır (Sanger et al., 1977). Örnekler %6?lık denatüre edici poliakrilamid jelde ayrıştırılarak, otoradyografi ile görüntülenir. Çalışılan gen amplifiye edildikten sonra enzimatik ön muamele yapılır. Bu amaçla hidrolitik enzimler (alkalin fosfataz ve ekzonükleaz I ) kullanılır. Ekzonükleaz I ortamdaki tek zincirli DNA iplikciklerini, alkalin fosfataz ise dNTP?leri uzaklaştırarak, dizi reaksiyonu için kullanılacak amplifikasyon ürününün temizlenmesini sağlar. İşlem tamamlandıktan sonra enzimleri inaktive etmek için, örnek karışımı 80 0 C?da 15' bekletilir.Primer tutunma reaksiyonu Temizlenmiş amplifikasyon ürünü üzerine primer ilave edilir. Karışım 100 0 C? da inkübe edildikten sonra, önce buzlu su içinde, sonra buzda bekletilir. Örneğin bu şekilde kademeli olarak soğutulması, kalıp katlanmasını ve primerlerin kendi aralarında eşleşmesini önler.İşaretleme reaksiyonu İşaretleme reaksiyonu için dört farklı tüp hazırlanır. Her bir tüp dört çeşit dNTP?nin yanısıra bir ddNTP içerir. Bu aşamada kullanılan DNA polimeraz T7 bakteriofaj DNA polimerazının modifiye formudur. Bu enzim 3„5' ekzonükleaz aktivitesi içermez. Enzimin polimerizasyon hızı çok yüksek olup, DNA zincirine ddNTP takabilme özelliğine de sahiptir. Reaksiyon karışımı 5' oda sıcaklığında bekletilir. İşaretleme aşamasında kullanılan işaretleme çözeltisi üç farklı dNTP içerir. Dördüncü tip dNTP, karışıma ilave edilen radyoaktif işaretli dNTP?dir.Sonlandırma reaksiyonu Zincir sonlanması 3'OH grubu bulunmayan nükleotit analoglarının (ddNTP) zincire takılması ile sağlanır. Dört farklı sonlandırma çözeltisinin her biri 80µl eşit dNTP (A; C; G; T) ve 8µl tek bir bazın ddNTP? sini içerir. Sonlandırma için hazırlanan tüplerin her birine sonlandırma çözeltisi reaksiyon karışımından ilave edilir. Tüplere formamid içeren durdurma çözeltisi eklenerek reaksiyon durdurulur. Bu örnekler jele yüklemeden önce denatüre edilir.Reaksiyon Ürünlerinin Elektroforezi Örneklerin görüntülenmesi için ürünler denatüre edici poliakrilamid jel elektroforezine tabi tutulurlar. Jel hazırlandıktan ve polimerizasyon işlemi tamamlandıktan sonra ortamda kalan üre temizlenir. Elektroforez tamponu olarak 1X TBE kullanılır. Sisteme 70 watt, 1800 volt ve 50mA elektrik akımı verilerek 15-30? ön elektroforez uygulanır. Bu uygulama tamlandıktan sonra yapılan DNA Dizi Analizi reaksiyonları jele yüklenerek 2.5-3 saat yürütme yapılır.Reaksiyon Ürünlerinin Otoradyografisi Elektroforez bitiminde jel, asetik asit – metanol karışımında bekletilir, Whatmann 1MM kromatografi kağıdı üzerine alınarak jel kurutucuda kurutulur. Kuruma sonrası X-ışınına duyarlı filmle kaplanır. 1-2 gün boyu oda sıcaklığında karanlık odada tutularak otoradyografisi alınır.Otomatik DNA Dizi Analizi Otomatik dizi analizi için çoğaltılan PCR ürünleri çeşitli yöntemler kullanılarak temizlenir. En sık kullanılan temizleme yöntemi ticari kitlerin kullanıldığı silika temelli yöntemlerdir.İşaretleme Reaksiyonu Otomatik Dizi Analizi ticari olarak üretilen kitler kullanılır. En sık olarak ABI Prism Big DyeTM Terminatör Reaksiyon Kiti kullanılır. Bu PCR kitinin özelliği tüm PCR kimyasalları ile beraber, floresan boyalı ddNTP?ler ile Taq DNA Polimeraz enzimini de tek bir karışım halinde bulundurmasıdır. “Big Dye Ready Reaction Mix” olarak adlandırılan bu karışıma sadece primer ve temizlenmiş kalıp DNA eklenir ve PCR başlatılır.• BigDye Terminatör A C G T DNA Polymerase, dNTP?s and DyeDeoxyterminator s Bağlanma Uzama Ürünler ACCGTA ACCGT ACCG ACC AC A T A A C C G TFluorescent Dyes Used in 4-Color Detection FAM (Blue) JOE (Green) TAMRA (Yellow) ROX (Red)Amplifikasyon Koşulları 1 amplifikasyon tüpü (20 µl) için reaksiyon karışımı Kalıp DNA 8.0 µl Big Dye Ready Reaction Mix 8.0 µl Primer (3.2pmol / µl) 1.0 µl Distile su 3.0 µl96 0 C „ 10?? 24 döngü; 50 0 C„ 5?? 60 0 C„ 4?? 4 0 C? 10? 1 döngü; PCR ProgramıÖrneklerin Hazırlanması Örnek hazırlama sırasında amplifikasyon ürünü izopropanol çöktürmesi ile PCR artıklarından temizlenir. Bu aşama özellikle reaksiyona girmemiş floresan boyalı ddNTP? lerin uzaklaştırılması açısından da çok önemlidir. İşlem uygun şekilde yapılamazsa kontaminant boyalar lazer tarafından okunacak ve analizin hassasiyetini bozacaktır.Örneğin Cihaza Yüklenmesi ve Elektroforezin Başlatılması Örnekler izopropanol ile temizlenip alkol tamamen uzaklaştırıldıktan sonra işaretleme reaksiyonu ürünleri formamid veya TSR içinde çözülür. Örnekler denatüre edildikten sonra buz içinde şoklanarak cihaza yüklenir ve elektroforez başlatılır. Yürütme işlemi 15 kV gerilim ve 50 o C sıcaklıkta gerçekleştirilir. ABI 310 Filter Set F 520 540 560 580 600 620 640 WAVELENGTH (nm) 100 80 60 40 20 0 5-FAM JOE NED ROX Laser excitation (488, 514.5 nm) Fluorescent Emission Spectra for ABI DyesThese values are used by the GeneScan ? Analysis Software to separate the various dye colors from one another. The letters B, G, Y, and R represent the dye colors Blue, Green, Yellow, and Red, respectively. Matrix File Table from an ABI 310 1.0000Sonuçların Değerlendirilmesi Elektoroforez işlemi tamamlandıktan sonra bilgisayar ana menüsünden “Sequence Analysis” programı açılır ve yürütülen örnek burada analiz edilir.Otomatik Dizi Analizi Cihazları 1- Jel Sistemli Cihazlar (ABI Prism 370, 373, 377) 2- Kapiler Sistemli Cihazlar (ABI Prism 310, 3100, 3700)ABI Prism 377 ABI Prism 377Sample Detection CCD Panel Color Separation Ar+ LASER (488 nm) LASER (488 nm) Fluorescence ABI Prism spectrograph Capillary or Gel Lane Size Separation Labeled DNA fragments (PCR products) Detection regionABI 310 PRISMKapiller Elektroforez High Voltage (+) anode (-) cathode CapillarySTANDARD OPERATION ? CAPILLARY FILL ? PRE-ELECTROPHORESIS ? WATER WASH OF CAPILLARY ? SAMPLE INJECTION ? WATER WASH OF CAPILLARY ? ELECTROPHORESIS ? DETECTIONSample Tube DNA - - Electrokinetic Injection Process Electrode Capillary - Q is the amount of sample injected r is the radius of the capillary c s is the sample concentration E is the electric field applied t is the injection time ? s is the sample conductivity ? b is the buffer conductivity ? ep is the mobility of the sample molecules ? eo is the electroosmotic mobility Rose et al (1988) Anal. Chem. 60: 642-648 Q = ? s ?r 2 c s ( ? ep + ? eo )Et ? bABI Prism 310 Genetic Analyzer capillary Syringe with polymer solution Autosampler tray Outlet buffer Injection cathode Inlet buffer Stepper Motor Laser Anode Heat Plate Pump BlockABI Prism 310 Genetik Analizör Cihazı?na ait elektrot ve kapiler Enjeksiyon Elektrodu Kapiler Örnek TepsisiABI Prism 3100 Cihazın İç YapısıLong Read BigDye™ Terminator v 3.0, 80 cm Capillary Array 3100 Genetic AnalyzerABI Prism 3700Manuel Yöntem ? Maliyeti düşük ? Daha fazla işgücü gerekir ? En fazla 350 bç okunabilir ? İlk radyoaktif dATP zincire eklendikten sonra okuma başlar ? Daha fazla zaman alır Otomatik Yöntem ? Maliyeti yüksek ? Daha az işgücü gerekir ? 1000 baz çifti okunabilir ? Primerden hemen sonra okunabilir ? Daha kısa süre alır? Otomatik sekansın teorik kapasitesi ? 24 kapiller sekans aletinin kapasitesi 2.7 milyon baz/yıl ? Tüm insan genomu sekansında bir tek cihaz kullanılırsa1000 yıl gerekli ? Bu nedenle 96 ve 384 kapiller sekans aletleri geliştirilmiştir. ? Slab jel ?kapiller sistem= 24 saat/9 yürütme ? 1-6 milyon baz/1 ay/ 1 sekans aleti ? Amersham Megabase 1000 ile 450 000 baz / 1 gün ? Büyük genomlar için birçok lab. birarada çalışmakta ve günde 18 milyon bazın sekansını yapabilmektedir.İnsan genom projesinde kullanılan sekanslama stratejileri 1- BAC temelli sekanslama 2- tüm genom shutgun stratejisi BAC temelli sekanslama İnsan genomu yaklaşık 150-200 kb uzunluğunda fragmentlere ayrıldı. Bu fragmentler BAC vektörlere klonlanarak insan genomunun BAC kütüphanesi oluşturuldu. BAC kütüphanesi yaklaşık 20 000 kadar BAC klonundan oluşmaktaydı. Daha sonra her bir BAC klonu insan genomundaki yerinin belirlenmesi amacıyla haritalandı.Dizi analizi için her bir BAC klonu yaklaşık 2000 bp?lik daha kısa fragmentlere parçalandı. Bu subklonların dizi analizi yapılarak bilgisayarlar kullanılarak birleşme noktalarından faydalanılarak her bir BAC klonunun dizisi çıkarıldı. Daha sonra haritalanan BAC klonları birleştirilerek tüm genomun dizisi çıkarıldı.Tüm Genom Shutgun Stratejisi Dr. J. Craig VENTER ve arkadaşları tarafından geliştirilen bu yöntem haritalamaya gereksinim duymadığından zaman ve işgücü açısından tassarruf sağlamaktadır. Bu yöntemde önce genom yaklaşık 2000 ve 10000 bp?lik küçük fragmentlere ayrılır daha sonra bu fragmentler plazmit vektörlere klonlanarak çoğaltıldıktan sonra dizisi çıkarılır. Bu diziler bir algoritm programı ile birleştirilerek genomun dizisi çıkarılır.Bu teknik basit olarak görünse de insan genomu gibi büyük genomlara uygulandığında kısa bir süre içinde milyonlarca fragmentden elde edilen dizilerin kısıtlı bir sürede birleştirilmesi gerekmektedir. Ayrıca yöntem çok sayıda yüksek kapasitede çalışabilecek sekansır ve sekansı çıkarılan dizilerin birleştirilmesi için bilgisayar sistemlerine gereksinim duymaktadır. Venter bu amaçla TIGR?yı (The Institute for Genome Research) kurarak milyonlarca fragmenti biraraya getirmek için Algoritm programı geliştirdi.Bu algoritmayı kullanarak Venter ve arkadaşları 1.8 milyon bp?den oluşan Haemophilus influenza genomunun dizisini çıkardılar. Venter ve arkadaşları bu yöntemi insan genomuna uygulamaya karar verdiklerinde bir çok araştırıcı bu yöntemin insan gibi milyonlarca repetatif DNA içeren büyük genomlarda başarılı olmayacağını öne sürmekteydi. Ocak 1998?de yüksek kapasiteli 3700 cihazlarının ve shutgun sekans algoritmasının geliştirilmesi ile insan genom projesi hız kazandı. Mayıs 1998?deVenter, 300 adet 3700 ve çok sayıda yüksek kapasiteli bilgisayar alarak Celera Genomics şirketini kurdu ve İnsan genomunun dizisinin 3 yıl içinde tamamlanacağını duyurdu. Venter ve arkadaşları 9 ay içinde insan genomunun taslağını çıkarmayı başararak yöntemlerinin başarılı olduğunu kanıtladılar.Haziran 2000?de insan genom projesinin tamamlandığı açıklandı. Ancak açıklanan diziler taslak diziler olup düzeltilmesi gerekiyordu. İki grup bir arada çalışarak nisan 2003 yılında diziye son şeklini verdiler Haziran 2000 ? Genomun %90’ını içeriyor ? Hata oranı yaklaşık 1000 bazda 1 ? 150 000 gap bulunuyor ? Genomun %28’i bitiş standardına uygun Nisan 2003 ? Genomun %99’unu içeriyor ? Hata oranı yaklaşık 10000 bazda 1 ? 400 gap bulunuyor ? Genomun %99’i bitiş standardına uygun